Agonistas dos receptores canabinoides do tipo 2 aumentam a produção de óxido nítrico em células do músculo liso vascular

Abstract

Introdução: Estudos recentes vêm demonstrando os potenciais efeitos terapêuticos após a ativação do receptor canabinoide tipo 2 (CB2) em uma variedade de modelos pré-clínicos. A modulação dos receptores CB2 pode ser útil no tratamento da dor, aterosclerose, isquemia e danos de reperfusão, fibrose renal e hepática, câncer e osteoporose. No entanto, a expressão e o papel dos receptores CB2 em células do músculo liso vascular (VSMC) em um contexto inflamatório não foram elucidados. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar a expressão e os efeitos da ativação dos receptores CB2 na produção de óxido nítrico (NO) e a viabilidade de VSMC desafiados com lipopolissacarídeo (LPS) e interferon-gama (IFN-y). Métodos: A linhagem celular A7r5 derivada de aorta de rato foi mantida em frascos de cultura contendo meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS); pH 7,4, 37 °C, em atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Células (4 x 104/poço) foram semeadas em placas de 96 poços e deixadas para aderir por 6 ou 24 horas. Então, elas foram incubadas com agonistas de CB2 AM1241 (10 nM - 1 µM) e β-cariofileno (0.1 µM - 10 µM), antagonista AM630 (0.1 - 10 µM) ou veículo (DMSO 0,1%). Após mais 24 horas, LPS (1 µg/mL) mais IFN-y (100 U/mL) foi adicionado aos poços e 24, 48 e 72 horas depois, o sobrenadante da cultura foi obtido para determinação de nitrito através da reação de Griess. O ensaio MTT foi realizado para avaliar a viabilidade celular. A expressão dos receptores CB2 foi investigada através de Western blotting. Resultados: Western blotting mostrou que as células A7r5 têm o receptor CB2. Células desafiadas com LPS/IFN-y produziram NO, mas células pré-tratadas com agonistas do receptor CB2 AM1241 e β-cariofileno e ativadas com LPS/IFN-y exibiram níveis significativamente maiores de NO. O aumento de NO não foi observado em células pré-tratadas com agonistas do receptor CB2 na ausência de LPS/IFN-y. As células pré-tratadas com o antagonista AM630, em conjunto dos agonistas, parecem estar diminuindo os níveis de NO. Conclusão: Foi mostrada pela primeira vez a presença de receptores CB2 em células A7r5. A ativação desses receptores com agonistas CB2 aumentou a produção de NO de células desafiadas com LPS/IFN-y, enquanto o antagonista parece estar diminuindo a produção de NO. Os mecanismos envolvidos serão investigados mais detalhadamente.

Introduction: Recent studies have been demonstrated the potential therapeutic effects following activation of cannabinoid receptor type 2 (CB2) in a range of preclinical models. Modulation of CB2 receptors may be helpful in the treatment of pain, atherosclerosis, ischemia and reperfusion damage, kidney and liver fibrosis, cancer and osteoporosis. However, the expression and role of CB2 receptors in vascular smooth muscle cells (VSMC) in an inflammatory context has not been elucidated. Therefore, the aim of this study was to investigate the expression and the effects of activation of CB2 receptors on nitric oxide (NO) production and viability of VSMC challenged with lipopolysaccharide (LPS) and gamma-interferon (IFN-y). Methods: Cell line A7r5 derived for rat aorta was maintained in culture flasks containing Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% of fetal bovine serum (FBS); pH 7.4, 37 °C, in a humid atmosphere containing 5% CO2. Cells (4 x 104/well) were plated on to 96-well plates and were allowed to adhere for 6 or 24 hours. Then, they were incubated with CB2 agonists AM1241 (10 nM - 1 µM) and β caryophyllene (0.1 µM - 10 µM), antagonist AM630 (0.1 - 10 µM) or vehicle (DMSO 0.1%). After another 24 hours, LPS (1 µg/mL) plus IFN-y (100 U/mL) was added to the wells and 24, 48 and 72 hours later, the cell supernatant was obtained for determination of nitrite through Griess reaction. MTT assay was performed to assess cell viability. The expression of CB2 receptors was investigated through Western blotting. Results: Western blotting has shown that A7r5 cells have CB2 receptor. Cells challenged with LPS/IFN-y produced NO but cells pre-treated with CB2 receptor agonists AM1241 and β-caryophyllene and activated with LPS/IFN-y exhibited significant higher NO levels. The increase in NO was not observed in cells pre-treated with CB2 receptor agonists in the absence of LPS/IFN-y. Cells pre-treated with the AM630 antagonist together with the agonists appear to be reducing NO levels. Conclusion: It’s have shown for the first time the presence of CB2 receptors in A7r5 cells. The activation of these receptors with CB2 agonists increased the NO production of cells challenged with LPS/IFN-y, while the antagonist appears to be decreasing NO production. The mechanisms involved will be further investigated.