Isolamento de bacteriófagos da cavidade oral para biocontrole bacteriano

Abstract

Os bacteriófagos, vírus capazes de infectar bactérias, têm sido propostos como alternativa para biocontrole de bactérias. Assim, este estudo objetivou bioprospectar novos bacteriófagos e aplicá-los em superfícies de titânio visando o biocontrole de Enterococcus faecalis e Serratia marcescens. As amostras biológicas foram coletas da cavidade oral a partir do sulco gengival e bolsa periodontal (profundidade de sondagem >3mm). Vinte e seis bacteriófagos, das quatorze amostras de bolsa periodontal incluídas, foram isolados pela técnica de duplo ágar, bem como oito bacteriófagos de quatorze amostras do sulco gengival de pacientes saudáveis. Após as sucessivas passagens, os bacteriófagos permaneceram estáveis e com altos títulos virais variando de >1E+4 a 1E+12. O perfil lítico foi analisado quanto a morfologias das placas de lise, incluindo turbidez, forma, halo, motilidade, tamanho e diâmetro das Unidades Formadoras de Placas (UFPs). Com base nos resultados obtidos, sete bacteriófagos foram selecionados para realização da Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), sendo eles: PPPSM1, PPGSM4, PPPSM6, PPGSM14, GSPSM18, GSPSM26 e GSPSM27. As caracterizações morfológicas revelaram bacteriófagos pertencentes às famílias Podoviridae, Corticoviridae, Microviridae, Cystoviridae e Inoviridae. Tendo em vista as características biológicas e morfológicas, o bacteriófago PPPSM1 foi selecionado para avaliação da capacidade de controle e redução das bactérias Enterococcus faecalis e Serratia marcescens, em superfícies de titânio, por meio da prevenção da formação e desagregação do biofilme formado. Para este experimento, utilizou-se 1.000 Unidades Formadoras de Placas (UFPs) de bacteriófagos, para 1 Unidade Formadora de Colônia UFC de bactéria [1000:1] (MOI 1000) em superfícies de titânio em três experimentos realizados independentemente. As análises de redução do crescimento bacteriano foram realizadas por meio de contagem de células viáveis, Microscopia de Fluorescência (MF) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). O bacteriófago PPPSM1 foi efetivo na redução de células bacterianas viáveis, prevenção da formação e desagregação do biofilme já formado em até 1 log (p=0,0245) da superfície tratada. Assim, o tratamento profilático com o bacteriófago obteve maior eficiência quando comparado com o tratamento de desagregação do biofilme. Em conclusão, os achados deste estudo colaboram para o avanço da terapia com bacteriófagos, especialmente na Periimplantite. Adicionalmente, oferecem uma possível alternativa para o biocontrole de patógenos oportunistas, proporcionando benefícios como redução da carga bacteriana, penetração no biofilme e minimização da resistência bacteriana. Estudos adicionais devem ser realizados para confirmar esses achados in vivo.

Bacteriophages, viruses capable of infecting bacteria, have been proposed as an adjunctive alternative for biocontrol of bacteria. Therefore, this study aimed to bioprospect new bacteriophages and apply them to titanium surfaces for biocontroling Enterococcus faecalis and Serratia marcescens. Biological samples were collected from the oral cavity, including the gingival sulcus and periodontal pocket (probing depth >3mm). In total, 26 bacteriophages from 14 periodontal pocket samples were isolated using the double agar technique, as well as 8 bacterio-phages from 14 gingival sulcus samples of healthy patients. After successive passages, the bacteriophages remained stable with high viral titers ranging from >1E+4 to 1E+12. The lytic profile was analyzed based on plaque morphology, including turbidity, shape, halo, motility, size, and Plaque Forming Units (PFUs) morphology. Based on the results obtained, seven phages were selected for transmission electron microscopy (TEM): PPPSM1, PPGSM4, PPPSM6, PPGSM14, GSPSM18, GSPSM26, and GSPSM27. The morphological characterizations revealed phages belonging to the families Podoviridae, Corticoviridae, Microviridae, Cystoviridae, and Inoviridae. Based on the findings, 7 bacteriophages were selected for transmission electron microscopy (TEM), specifically: PPPSM1 PPGSM4, PPPSM6, PPGSM14, GSPSM18, GSPSM26, and GSPSM27.Morphological characterizations revealed bacteriophages belonging to the families Podoviridae, Corticoviridae, Microviridae, Cystoviridae, and Inoviridae. Given the biological and morphological characteristics, the bacteriophage PPPSM1 was selected for evaluation of its capacity to control and reduce Enterococcus faecalis and Serratia marcescens on titanium surfaces by preventing biofilm formation and disaggregating already formed biofilms. For this experiment, 1,000 PFUs of phages were used and 1 CFU of bacteria [1000:1] (MOI 1000) were used on titanium surfaces in three independently experiments. The analysis of bacterial growth reduction was performed through viable cell counting, Fluorescence Microscopy (FM), and Scanning Electron Microscopy (SEM). Bacteriophage PPPSM1 was effective in reducing viable bacterial cells, preventing biofilm formation, and disaggregating up to 1 log (p=0,0245) of the biofilm on the treated surface. Therefore, the prophylactic treatment with bacteriophage was more efficient com-pared to the biofilm disaggregation treatment. In conclusion, the findings of this study contribute to the advancement of phage therapy, particularly in Periimplantitis. Additionally, they offer a potential alternative for the biocontrol of opportunistic pathogens, providing benefits such as reducing bacterial load, penetrating biofilms, and minimizing bacterial resistance. Further studies are needed to confirm these findings in vivo.