Análise da senescência replicativa durante a amplificação in vitro de células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo canino

Abstract

As Células Estromais Mesenquimais (MSCs, do inglês Mesenchymal Stromal Cells) têm sido estudadas para fins regenerativos há anos. Na medicina veterinária, e particularmente em cães, as MSCs derivadas do tecido adiposo canino (cAD-MSCs) possuem potencial para o tratamento de diversas doenças degenerativas. No entanto, poucos estudos avaliam características adquiridas durante a manipulação in vitro e expansão celular, como a senescência, que impactam a atividade terapêutica dessas células. Desse modo, este estudo teve como objetivo avaliar as características senescentes de cAD-MSCs durante a amplificação in vitro. As cADMSCs foram obtidas de cães saudáveis, caracterizadas segundo as diretrizes da International Society of Cell and Gene Therapy (ISCT) e então cultivadas até a passagem 7 (P7). Foram avaliados os seguintes parâmetros: morfologia, potencial de autorrenovação e proliferação celular, capacidade de fechamento de ferida in vitro, atividade de ß-galactosidase associada à senescência (SA-ß-Gal), níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), incidência de apoptose/morte celular e ocorrência de danos nucleares e genéticos. As células obtidas exibiram características mesenquimais e mostraram susceptibilidade à senescência durante a expansão. As cAD-MSCs apresentaram diminuição progressiva da proliferação após P4 e, a partir de P5, reduzida capacidade de autorrenovação, alterações na morfologia, aumento da ocorrência de alterações nucleares do tipo broto e atividade elevada de SA-ß-Gal. Em P7, foi observado aumento no marcador de quebra de dupla fita de DNA ?-H2AX e nos níveis de EROs, acompanhado de diminuição no potencial de fechamento de feridas. Em conjunto, os resultados evidenciam a progressão do fenótipo de senescência replicativa das cAD-MSCs durante a expansão in vitro. Essas descobertas não só fornecem informações cruciais para a aplicação das cAD-MSCs na medicina veterinária, mas também ressaltam a importância de se considerar cuidadosamente as características das passagens celulares a serem utilizadas. Em particular, as passagens iniciais (P1-P3) se apresentam como desejáveis para a manutenção das características mesenquimais das células destinadas à aplicação clínica.

Abstract: Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) have been under study for regenerative purposes for years. In veterinary medicine, canine adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells (cAD-MSCs) hold the potential for treating various degenerative diseases in dogs. However, clinical trials often lack details on cell expansion, hindering the identification of characteristics acquired during in vitro manipulation, such as cellular senescence, which can impact their therapeutic activity. Thus, there is a need for a comprehensive characterization of replicative senescence in these cells. Therefore, this study aimed to identify the emergence of senescent characteristics in cAD-MSCs during amplification, constructing a timeline of their in vitro lifespan. cADMSCs were obtained from healthy dogs, characterized following the International Society of Cell and gene Therapy (ISCT) guidelines, and then cultured until passage 7 (P7). The following parameters were evaluated: cellular morphology, self-renewal, proliferation, in vitro wound closure capacity, senescence-associated ß-galactosidase activity (SA-ß-Gal), reactive oxygen species (ROS) levels, incidence of apoptosis/cell death, and genetic and nuclear damages. The obtained cells exhibited mesenchymal characteristics and showed susceptibility to cellular senescence during expansion. The proliferation rate of cAD-MSCs started to decrease at P4. From P5, cAD-MSCs showed reduced self-renewal capacity, alterations in cell size and morphology, increased occurrence of nuclear buds, and elevated SA-ß-Gal activity. At the late passage (P7), there was an increase in the ?-H2AX double-strand break marker, an increase in ROS levels, and a decrease in wound closure potential. Collectively, these results demonstrate the progression of the replicative senescence phenotype in cAD-MSCs, specifying when each senescent characteristic arises during in vitro expansion. These findings provide crucial information for the application of cAD-MSCs in veterinary medicine and emphasize the importance of carefully considering the characteristics of cell passages. Therefore, early passages (P1-P3) are suggested as desirable for maintaining the mesenchymal characteristics of cells intended for clinical application.