Viabilidade celular de Herbaspirillum sp. e análise de genômica comparativa do gênero Herbaspirillum

Abstract

Bactérias do gênero Herbaspirillum foram isoladas de diversos tipos de ambientes e localizações geográficas, e o gênero apresenta grande diversidade. Herbaspirillum seropedicae é a espécie mais estudada do gênero, principalmente devido seu potencial para ser utilizada como inoculante. Métodos confiáveis, de alto rendimento e econômicos são necessários para determinar a viabilidade bacteriana em formulações de inoculantes ou em plantas. O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver um ensaio de avaliação da viabilidade celular de Herbaspirillum seropedicae em raízes de milho utilizando a metodologia PMA-qPCR e comparar os genomas do gênero Herbaspirillum para estabelecer a diversidade gênica do gênero. H. seropedicae foi cultivada em meio de cultura e submetida a tratamento térmico a 48 °C por diferentes períodos de tempo. Raízes de milho foram inoculadas, cultivadas in vitro e coletadas sete dias após a inoculação. As células viáveis de bactérias foram quantificadas usando ensaios de qPCR, PMA-qPCR e contagem em placa. Foram elaboradas curvas padrão e a eficiência obtida variou de 85 a 99%. O limite de detecção (LOD) foi de 101 cópias do genoma, correspondendo a 60,3 pg de DNA. As enumerações obtidas em culturas puras por qPCR, PMA-qPCR e contagem de placas foram 8,85 ± 0,16, 6,51 ± 0,12 e 2,25 ± 0,30 log UFC.mL-1 após tratamento térmico, respectivamente. Esses resultados mostraram que o PMA-qPCR é uma abordagem adequada para quantificar células viáveis e viáveis, mas não cultiváveis em inoculantes e plantas. O PMA-qPCR permitiu obter resultados confiáveis mais rapidamente do que os métodos dependentes de cultura. Em relação a comparação do genoma, usando uma filogenia robusta do genoma central, foi constatado que todas as espécies descritas do gênero Herbaspirillum estão bem delineadas, sendo a única exceção os clados das espécies H. aquaticum e H. huttiense. Também foi constatado que os genes nif são altamente prevalentes apenas em H. rubrisubalbicans; no entanto, independente da espécie, todos os genes nif compartilham o mesmo arranjo gênico com alta identidade proteica e estão presentes em apenas dois tipos principais, em fitas invertidas. Por meio de uma árvore filogenética NifHDKENB, foi observado que as sequências nif de Herbaspirillum podem ter sido adquiridas do último ancestral comum pertencente à ordem Nitrosomonadales.

Abstract: Bacteria of the genus Herbaspirillum were isolated from different types of environments and geographic locations, and the genus presents high diversity. Herbaspirillum seropedicae is the most studied species of the genus, mainly due to its potential to be used as an inoculant. Reliable, high-throughput, and cost-effective methods are needed to determine bacterial viability in inoculant formulations or on plants. The general objective of this work was to develop an assay to evaluate the cellular viability of Herbaspirillum seropedicae in maize roots using the PMA-qPCR methodology and to compare the genomes of the genus Herbaspirillum to establish the genetic diversity of the genus. H. seropedicae was cultivated in culture medium and subjected to heat treatment at 48 °C for different periods of time. Maize roots were inoculated, grown in vitro and collected seven days after inoculation. Viable bacterial cells were quantified using qPCR, PMA-qPCR assays and plate counting. Standard curves were prepared and the efficiency obtained ranged from 85 to 99%. The limit of detection (LOD) was 101 genome copies, corresponding to 60.3 pg of DNA. The enumeration obtained in pure cultures by qPCR, PMA-qPCR and plate counts were 8.85 ± 0.16, 6.51 ± 0.12 and 2.25 ± 0.30 log CFU.mL-1 after heat treatment, respectively. These results showed that PMA-qPCR is an adequate approach to quantify viable and viable but non-culturable cells in inoculants and plants. PMA-qPCR allowed the achievement of reliable results much faster than culture-dependent methods. Concerning genome comparison, using a robust phylogeny of the central genome, it was found that all described species of the genus Herbaspirillum are well delineated, with the only exception being the clades of the species H. aquaticum and H. huttiense. It was also found that nif genes are highly prevalent only in H. rubrisubalbicans; however, regardless of species, all nif genes share the same gene arrangement with high protein identity and are present in only two main types, in inverted strands. Through a phylogenetic tree NifHDKENB, it was observed that the nif sequences of Herbaspirillum may have been acquired from the same last common ancestor belonging to the order Nitrosomonadales.