Análise de marcadores bioquímicos, alterações nucleares e danos ao DNA no líquido amniótico e sangue materno e sua correlação com alterações cromossômicas e malformações fetais

Abstract

O período gestacional é acompanhado por importantes mudanças físicas, hormonais e bioquímicas que permitem que se atinja um estado ideal, tanto para a mãe quanto para o embrião/feto. Quando a gestação se desvia do curso esperado, alguns marcadores podem ser usados para avaliar essas mudanças. O líquido amniótico (LQAM), por estar em contato direto com o embrião/feto, consiste em uma importante ferramenta para procedimentos de diagnóstico pré-natal. Marcadores bioquímicos como alfafetoproteína, homocisteína, vitamina B12 e folato foram estudados em relação à sua participação na ocorrência de malformações fetais. A determinação do cariótipo é a análise padrão para o diagnóstico de anomalias genéticas, enquanto a instabilidade genômica pode ser medida por meio das técnicas de cometa e micronúcleo. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar a possível representação entre marcadores bioquímicos com o dano ao DNA no LQAM e sangue materno, de gestantes com malformações fetais (GMF), submetidas à amniocentese. Foram quantificados marcadores imunológicos no sangue e LQAM e verificados sua representação com marcadores de danos ao DNA nos grupos treinados. Os resultados mostraram que dos 67 cariótipos específicos, 34 apresentaram alguma alteração, numérica ou estrutural. As principais aneuplodias encontradas foram a trissomia do 13, 18 e 21. Não foi verificada deficiência de folato e de vitamina B12 nos grupos treinados. A alfafetoproteína apresentou brilho negativo entre soro e LQAM, já vitamina B12, folato e homocisteína brilho positivo. As dosagens de alfafetoproteína foram maiores no LQAM de gestantes com fetos com trissomia do 13 e 18 com relação do 21. O índice total de dano ao DNA no sangue foi maior no grupo GMF em comparação aos grupos gestantes controle (GC) e não gestantes ( NG). As células do LQAM apresentaram maior dano em relação aos linfócitos no grupo GMF. O grupo GMF apresentou aumento de micronúcleos em comparação aos grupos GC e NG. GMF não difere do grupo GC em relação às alterações pontes (NPB) e proteínas (NBUD) nucleares. As dosagens de marcadores inflamatórios contêm concentrações maiores de MCP-1 e IL-1ß no sangue de GMF em comparação com GC. Comparando as concentrações dos marcadores inflamatórios entre sangue e LQAM do grupo GMF, IL-6 e MCP-1 apresentaram concentrações maiores no LQAM. TNF-a, IL-1ß e IFN-γ contêm concentrações maiores no plasma. IL-10 não difere. No sangue, foi encontrado brilho negativo entre IL-1ß e NBUD e brilho positivo entre IL-6 e IL-1ß com índice de divisão nuclear. No LQAM foi observado olhar positivo da idade gestacional (IG) com homocisteína e IFN-γ. Correlação negativa foi encontrada entre IG e alfafetoproteína, vitamina B12, folato, IL-10 e MCP-1. Os resultados obtidos pela técnica do cometa e frequência de micronúcleo indicam uma alta incidência de efeitos genotóxicos em mulheres gestantes com malformação fetal e em seus fetos. Esses resultados permitem questionar se a presença de alguma malformação leva ao aumento do dano ao DNA, ou se a predisposição ao dano favorece a ocorrência de malformações. A presença de aneuplodias corrobora o aumento do processo inflamatório, como distribuído nas concentrações sanguíneas de MCP-1 e IL-1ß em GMF.

Abstract: Gestational period is accompanied by important physiological, hormonal and biochemical changes that allow an ideal state to be reached for both the mother and the embryo/fetus. When pregnancy deviates from its expected course, some markers can be used to assess these changes. Amniotic fluid, as it is in direct contact with the embryo/fetus, is an important tool for prenatal diagnostic procedures. Biochemical markers such as alpha-fetoprotein, homocysteine, vitamin B12 and folate have been studied regarding their participation in the occurrence of foetal malformations. Karyotype determination is the standard analysis for diagnosing genetic abnormalities, while genomic instability can be measured using comet and micronucleus techniques. Thus, the objective of this work was to verify the possible correlation between biochemical markers and DNA damage in amniotic fluid (LQAM) and maternal blood, from pregnant women with foetal malformations (GMF), undergoing amniocentesis. Inflammatory markers were quantified in blood and amniotic fluid and their correlation with markers of DNA damage was verified in the groups studied. Results of research showed that of the 67 karyotypes determined, 34 presented some alteration, numerical or structural. The main aneuploidies found were trisomy 13, 18 and 21. There was no folate or vitamin B12 deficit in groups studied. Alpha-fetoprotein showed a negative correlation between serum and amniotic fluid, while vitamin B12, folate and homocysteine showed a positive correlation. Alpha-fetoprotein levels were higher in the amniotic fluid of pregnant women with foetuses with trisomy 13 and 18 compared to 21. The total rate of DNA damage in blood was higher in GMF group compared to pregnant control (GC) and non pregnant (NG) groups. Amniotic fluid cells showed greater damage compared to lymphocytes in the PFM group. The PFM group showed an increase in micronuclei compared to the GC and NG groups. GMF did not differ from the PC group regarding nuclear changes in nuclear bridges (NPB) and buds (NBUD). Dosages of inflammatory markers showed higher concentrations of MCP-1 and IL-1ß in blood of GMF group compared to PC. Comparing the concentrations of inflammatory markers between blood and amniotic fluid in the GMF group, IL-6 and MCP-1 showed higher concentrations in the amniotic fluid. TNF-a, IL-1ß and IFN-γ showed higher concentrations in plasma. IL-10 did not differ. In blood, a negative correlation was found between IL-1ß and NBUD and a positive correlation between IL-6 and IL-1ß with nuclear division index. In amniotic fluid, a positive correlation between gestational age (IG) and homocysteine and IFN-γ was observed. Negative correlation was found between IG and alpha-fetoprotein, vitamin B12, folate, IL-10 and MCP-1. Results obtained by comet technique and MN frequency indicate a high incidence of genotoxic effects in pregnant women with foetal malformations and their foetuses. These results allow us to question whether the presence of any malformation leads to increased DNA damage, or whether the predisposition to damage favored the occurrence of malformations. The presence of aneuploidies corroborates the increase in inflammatory process, as observed in blood concentrations of MCP-1 and IL-1ß in GMF.