Avaliação da atividade e expressão de enzimas antioxidantes e de parâmetros de estresse oxidativo em células de linhagem de astroglioma expostas a elevadas concentrações de cobre: Lara Stoeberl ; orientadora,Viviane Glaser.

Abstract

O cobre (Cu) é um oligoelemento essencial que desempenha um papel importante nas funções cerebrais, atuando, por exemplo, no sistema de defesa antioxidante e no metabolismo do ferro. No entanto, altos níveis celulares desse metal resultam em estresse oxidativo. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi analisar as alterações provocadas pelo excesso de cobre em parâmetros de estresse oxidativo, e na atividade e expressão de enzimas do sistema antioxidante, utilizando como modelo uma linhagem de astroglioma mais resistente às elevações de cobre (U-87 MG) e uma linhagem mais suscetível (C6). As células foram cultivadas na ausência ou presença de CuSO4 (0 - 600 µM) por 24h ou 48h. A atividade das enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa redutase (GR) e glutationa peroxidase (GPx) foram avaliadas espectrofotometricamente, assim como os níveis de tióis não proteicos (NPSH) e proteicos (PSH). A produção de superóxido foi determinada usando a sonda fluorescente dihidroetídio (DHE). Já a expressão dos genes que codificam para as enzimas antioxidantes GR, GPx1 e SOD1 foi determinada por RT-PCR em tempo real. Na linhagem C6 e U-87 MG foi possível observar uma diminuição da atividade das enzimas GPx, GR e CAT após 24h e 48h de exposição ao CuSO4, enquanto que para a SOD verificou-se um aumento em sua atividade após 24h de exposição ao toxicante, sendo que na linhagem U-87 MG isso foi verificado já nas concentrações iniciais de CuSO4; porém em 48h observou-se uma redução em sua atividade em ambas as linhagens. Em relação ao NPSH e PSH, verificou-se uma diminuição após 24h de exposição ao metal, sendo que nas células U-87 MG os níveis de PSH diminuíram somente em concentrações mais elevadas de CuSO4, e nas células C6 essa redução já é observada nas menores concentrações; assim como foi observado um aumento na geração de superóxido. Quanto à expressão dos genes que codificam para enzimas antioxidantes, observou-se uma redução no conteúdo de mRNA para GR após 24h de exposição ao metal, em ambas as linhagens. Por outro lado, verificou-se que houve um aumento no conteúdo de mRNA de GPx1 na linhagem C6 após o mesmo período de exposição ao CuSO4. Em relação à expressão do SOD1, observou-se que houve um aumento no conteúdo de mRNA nas células U-87 MG após exposição ao toxicante; por outro lado, na linhagem C6 verificou-se uma diminuição na expressão dessa enzima. Em conjunto, estes resultados indicam que altos níveis de Cu causam uma diminuição na atividade de enzimas antioxidantes e nos níveis de grupos tióis principalmente na linhagem mais suscetível ao cobre, podendo estar associado ao estresse oxidativo ou a uma interação direta entre Cu e as enzimas em seu sítio ativo. Por fim, conclui-se que existem diferenças espécie-específicas para a toxicidade do Cu, provavelmente devido a diferentes mecanismos de resposta ao estresse oxidativo, sendo que a linhagem derivada de humanos parece ser menos sensível ao excesso do metal em comparação com a linhagem proveniente de ratos.

Abstract: Copper (Cu) is an essential trace element that plays an important role in brain functions, acting, for example, in the antioxidant defense system and in iron metabolism. However, high cellular levels of this metal result in oxidative stress. Therefore, the aim of this study was to analyze the changes caused by excess copper in oxidative stress parameters, and in the activity and expression of enzymes of the antioxidant system, using as a model a astroglioma cell line that is more resistant to high levels of copper (U-87 MG) and a more susceptible cell line (C6). The cells were cultured in the absence or presence of CuSO4 (0 - 600 µM) for 24h or 48h. The activity of the enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione reductase (GR) and glutathione peroxidase (GPx) were evaluated spectrophotometrically, as were the levels of non-protein thiols (NPSH) and protein thiols (PSH). Superoxide production was determined using the fluorescent probe dihydroethidium (DHE). The expression of the genes coding for the antioxidant enzymes GR, GPx1 and SOD1 was determined by real-time RT-PCR. In both C6 and U-87 MG cell lines, it was possible to observe a decrease in the activity of the GPx, GR and CAT enzymes after 24h and 48h of exposure to CuSO4, while for SOD, there was an increase in its activity after 24h of exposure to the toxicant, and in the U-87 MG cells this was already seen in the initial concentrations of CuSO4; however, after 48h, a reduction in its activity was observed in both cell lines. In relation to NPSH and PSH, there was a decrease after 24 hours of exposure to the metal, and in the U-87 MG cells PSH levels only decreased at higher concentrations of CuSO4, while in the C6 cells this reduction was already observed at lower concentrations; as well as an increase in superoxide generation. As for the expression of genes coding for antioxidant enzymes, there was a reduction in the mRNA content for GR after 24 hours of exposure to the metal in both cell lines. On the other hand, there was an increase in the mRNA content of GPx1 in the C6 cell line after the same period of exposure to CuSO4. Regarding the expression of SOD1, it was observed that there was an increase in mRNA content in U-87 MG cells after exposure to the toxicant; on the other hand, in the C6 cell line there was a decrease in the expression of this enzyme. Taken together, these results indicate that high levels of Cu cause a decrease in the activity of antioxidant enzymes and in the levels of thiol groups, especially in the cell line most susceptible to copper, which may be associated with oxidative stress or with a direct interaction between Cu and the enzymes in its active site. Finally, we conclude that there are species-specific differences in Cu toxicity, probably due to different oxidative stress response mechanisms, and that the human-derived cell line appears to be less sensitive to excess metal compared to the rat-derived cell line.