Desenvolvimento de biossensores baseados em aptâmeros para detecção de saxitoxina por impedância eletroquímica

Abstract

A saxitoxina (STX) é uma neurotoxina que consumida em altas concentrações pode causar a morte em humanos e animais. Na Lagoa do Peri, localizada na Ilha de Florianópolis, capital de SC no Brasil, tem sido observada STX desde 1994, apesar disso, a lagoa abastece de água potável, após tratamento, a mais de 100 mil habitantes. Desde seu desenvolvimento, os aptâmeros (APTs) se tornaram um tipo muito atraente de sondas de reconhecimento molecular, sendo muito solicitados em vários campos, como monitoramento ambiental, análise biológica e segurança alimentar. Os APTs podem ser imobilizados sobre eletrodos para desenvolver aptasensores eletroquímicos que são dispositivos analíticos vantajosos para detecção sensível, contínua e em tempo real. Especificamente, aptasensores impedimétricos utilizam a espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE), a qual é uma técnica não invasiva, devido que não perturbam a amostra em estudo por causa dos sinais elétricos de baixa amplitude, esses aptasensores oferecem um sistema de baixo custo, portabilidade, capacidade de miniaturização e tempos de detecção rápidos usando quantidades mínimas de volumes de amostra. Nesse contexto, o aptâmero M-30f especifico para a STX foi funcionalizado com tiol para ser imobilizado por monocamadas automontadas (SAMs, Self-assembling monolayers) ou drop-casting em um eletrodo de ouro. O anti-incrustante 6-mercaptohexanol (MCH) foi aderido por automontagem para ocupar os espaços vazios deixados pelas imobilizações do M-30f. A caracterização eletroquímica em cada etapa do aptasensor foi por voltametria cíclica (VC) e EIE usando uma solução eletrolítica. Nas etapas de imobilização do M-30f e aderência do MCH, uma diminuição na corrente Faradaica e um aumento na resistência de transferência de carga (R_tc ) foram observados. Na detecção da STX, aconteceu o contrario, ou seja, um incremento na corrente Faradaica e um decréscimo ??R?_tc. Esse último decréscimo ??R?_tc foi utilizado para a detecção de STX, observando-se um decremento na R_tc proporcional ao aumento da concentração da STX, no aptasensor onde o M-30f foi imobilizado por drop-casting. O biossensor eletroquímico detectou a STX na faixa de concentrações entre 0,3 e 30 µg/L, a partir desses dados, uma curva de calibração para a detecção de STX foi feita, observando-se que um decremento ??R?_tc de 30% corresponde à concentração limite de 3 µg/L na água potável e que o limite de detecção obtido pelo aptasensor foi de 0,3 µg/L, correspondente a 10% da concentração limite da STX. Além disso, o biossensor demonstrou ser seletivo em experimentos de controle negativo com a microcistina-LR (MCLR), outra cianotoxina, indicando que não há alteração significativa no decréscimo ??R?_tc na presença de MCLR quando comparado com a STX, demonstrando ser uma alternativa promissora para a detecção da STX em água. Como aplicação prospectiva, o aptasensor pode ser testado em amostras reais de água da Lagoa do Peri, utilizando como referencia a curva de calibração obtida nesse trabalho.

Abstract: Saxitoxin (STX) is a neurotoxin that consumed in high concentrations can cause death in humans and animals. In Peri Lagoon, located on Florianópolis Island, capital of SC in Brazil, STX has been observed since 1994, despite this, the lagoon supplies drinking water, after treatment, to more than 100 thousand inhabitants. Since their development, aptamers (APTs) have become a very attractive type of molecular recognition probes, being much in demand in various fields such as environmental monitoring, biological analysis and food safety. APTs can be immobilized on electrodes to develop electrochemical aptasensors that are advantageous analytical devices for sensitive, continuous, real-time detection. Specifically, impedimetric aptasensors use electrochemical impedance spectroscopy (EIS), which is a non-invasive technique, as they do not disturb the sample under study because of low-amplitude electrical signals, these aptasensors offer a low cost, portability, miniaturization capability and fast detection times using minimal amounts of sample volumes. In this context, the STX-specific aptamer M-30f was functionalized with thiol to be immobilized by self-assembling monolayers (SAMs) or drop-casting on a gold electrode. The antifouling 6-mercaptohexanol (MCH) was adhered by self-assembly to fill the empty spaces left by the M-30f immobilizations. The electrochemical characterization in each step of the aptasensor was by cyclic voltammetry (CV) and EIS using an electrolyte solution. In the M-30f immobilization and MCH adhesion stages, a decrease in Faradaic current and an increase in charge transfer resistance (R_ct ) were observed. In the detection of the STX, the opposite happened, ie, an increase in the Faradaic current and a decrease ??R?_ct. This last decrease in R_ct was used for the detection of STX, observing a decrease in R_ct proportional to the increase in STX concentration, in the aptasensor where M-30f was immobilized by drop-casting. The electrochemical biosensor detected STX in the range of concentrations between 0,3- 30 µg/L, from this data, a calibration curve for the detection of STX was made, observing that a ??R?_ct decrement of 30% corresponds to the concentration limit of 3 µg/L in drinking water and that the detection limit obtained by the aptasensor was 0,3 µg/L, corresponding to 10% of the limit concentration of STX. Furthermore, the biosensor proved to be selective in negative control experiments with microcystin-LR (MCLR), another cyanotoxin, indicating that there is no significant change in the decrease in ??R?_ct in the presence of MCLR when compared to STX, demonstrating be a promising alternative for the detection of STX in water. As a prospective application, the aptasensor can be tested in real water samples from Peri Lake, using the calibration curve obtained in this work as a reference.