Efeitos histopatológicos e histoquímicos do herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético no fígado de peixes-zebra Danio rerio adultos

Abstract

A produção agrícola é na atualidade muito dependente do uso de agrotóxicos, que devido ao uso indiscriminado, podem causar sérios problemas de contaminação aos organismos e meio ambiente. O segundo princípio ativo de uso agrícola mais comercializado no Brasil é o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Este é um agrotóxico da classe dos herbicidas, que vem sendo usado amplamente no mundo há mais de 60 anos. O 2,4-D foi reclassificado para pouco tóxico segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Contudo, alguns estudos sugerem que este herbicida pode ocasionar efeitos tóxicos em organismos não-alvos. Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos do herbicida 2,4-D nos parâmetros histológicos e histoquímicos do fígado de peixes-zebra (Danio rerio) adultos. Os peixes-zebra machos foram divididos em 4 grupos e expostos por 7 dias as seguintes concentrações: 0,0 mg/L (grupo controle); 0,03 mg/L; 0,3 mg/L; 3,0 mg/L de 2,4-D. Após o tratamento, os animais foram eutanasiados, os fígados foram dissecados, processados e corados com Hematoxilina e Eosina (HE), Azul de Toluidina (ATO) e Azul Brilhante de Coomassie (CBB) para as análises histopatológicas e histoquímicas. Os resultados histopatológicos demonstraram que houve um aumento na frequência das lesões de acordo com o aumento da concentração do herbicida. Foram observadas diversas alterações celulares e vasculares como: vacuolização, hipertrofia celular e nuclear, deformação nuclear, desarranjo tecidual, dilatação sinusoidal, hiperemia e necrose. Foi calculado o índice de alterações histopatológica (IAH) para avaliar se as alterações encontradas podem estar afetando o órgão. Foi observado que os grupos 0,03 e 0,3 mg/L de 2,4-D apresentaram comprometimento moderado, enquanto o grupo 3,0 mg/L de 2,4-D apresentou danos irreparáveis ao tecido. Na análise estatística os valores do IAH diferiram entre os grupos controle e exposto a concentração de 3,0 mg/L de 2,4-D (controle vs 3,0 mg/L: p < 0,01). Na análise histoquímica com marcação para polissacarídeos ácidos, foi observada a diminuição em seus níveis nos grupos 0,03 e 3,0 mg/L em comparação ao grupo controle (controle vs. 0,03 mg/L: p < 0,001; controle vs. 3,0 mg/L: p < 0,001). A análise dos níveis de proteína total com CBB mostrou aumento nos grupos 0,03 e 0,3 mg/L de 2,4-D (controle vs. 0,03 mg/L, p < 0,001; controle vs. 0,3 mg/L: p < 0,003) e diminuição no grupo 3,0 mg/L em comparação ao grupo controle (controle vs. 3 mg/L: p < 0,001). Demonstramos neste trabalho que concentrações ambientalmente relevantes de 2,4-D podem causar alterações morfológicas e histoquímicas no tecido hepático de peixes-zebra machos. Então, este trabalho fornece evidências aos órgãos regulamentadores para que seja reavaliada a concentração máxima permitida de 2,4-D (0,03 mg/L) no Brasil.

Abstract: Agricultural production is currently very dependent on the use of pesticides, which due to indiscriminate use can cause serious contamination problems to organisms and the environment. The second most commercialized active ingredient in Brazil is 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). This is a pesticide from the herbicide class, which has been widely used in the world for over 60 years. 2,4-D was reclassified to low toxic according to the Agência Nacional de Vigilância Sanitaria (ANVISA). However, some studies suggest that this herbicide can cause toxic effects on non-target organisms. For this reason, the objective of this work was to investigate the effects of the herbicide 2,4-D on the histological and histochemical parameters of the liver of adult zebrafish (Danio rerio). Male zebrafish were divided into 4 groups: Control (0.0 mg/L); 0.03 mg/L; 0.3 mg/L; 3 mg/L of 2,4-D and were exposed for 7 days. After treatment, the animals were euthanized, and the liver was dissected, processed and stained with Hematoxylin and Eosin (HE), Toluidine Blue (ATO) and Coomassie Brilliant Blue (CBB) for histopathological and histochemical analysis of the tissue. The histopathological results showed that there was an increase in the frequency of lesions according to the increase in concentration. Several cellular and vascular alterations were observed, such as vacuolization, cellular and nuclear hypertrophy, nuclear deformation, tissue disarrangement, sinusoidal dilatation, hyperemia and necrosis. The histopathological alterations index (HAI) was performed to understand how these alterations may be affecting the organ, and it was observed that the groups 0.03 and 0.3 mg/L of 2,4-D present moderate impairment, while the group 3.0 mg/L of 2,4-D showed irreparable tissue damage. The calculation of the HAI showed a significant difference between the control group compared to the group exposed to a concentration of 3.0 mg/L of 2,4-D (Control vs 3.0 mg/L: p < 0, 01). In the histochemical analysis with ATO, a decrease in acid polysaccharide levels was observed in the 0.03 and 3.0 mg/L groups (Control vs. 0.03 mg/L: p < 0.001; Control vs. 3.0 mg /L: p < 0.001). Analysis of total protein levels with CBB showed an increase in the 0.03 and 0.3 mg/L groups of 2,4-D (Control vs. 0.03 mg/L, p < 0.001; Control vs. 0.3 mg/L: p < 0.003) and decrease in the 3.0 mg/L group (Control vs. 3 mg/L: p < 0.001). We demonstrated in this work that environmentally relevant concentrations of 2,4-D can cause morphological and biochemical changes in zebrafish liver tissue. In addition, this work provides evidence for regulatory bodies to reassess the maximum allowable concentration of 2,4-D (0.03 mg/L) in Brazil.