Expressão heteróloga de uma proteína quimérica pan-tripanosomatídeos em Leishmania tarentolae e Trypanosoma rangeli

Abstract

A doença de Chagas causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e as leishmanioses causadas por diferentes espécies do gênero Leishmania e acometem em conjunto cerca de 7-8 milhões de pessoas no mundo. A prevenção e o controle dessas doenças ainda são baseados primariamente no controle vetorial, sendo que os medicamentos disponíveis apresentam elevada toxicidade e baixa eficácia. Buscamos desenvolver neste estudo uma estratégia vacinal baseada no uso de tripanosomatídeos não patogênicos (L. tarentolae e T. rangeli) expressando uma proteína quimérica formada por genes que codificam epítopos imunogênicos conservados presentes em diferentes tripanosomatídeos patogênicos. Testes preliminares em camundongos imunizados com a proteína purificada revelaram uma redução da parasitemia pelo T. cruzi e uma redução das lesões e cargas parasitárias nos animais infectados com L. amazonensis, L. mexicana e L. infantum. No presente estudo, transfectamos promastigotas de L. tarentolae e epimastigotas de T. rangeli com o plasmídeo FlagGPI_pROCK Neo contendo o gene da quimera proteica. Ainda durante a seleção dos transfectantes com geneticin (G-418), a presença do plasmídeo verificada através de PCR e a expressão da proteína quimérica foi avaliada indiretamente pela detecção da expressão de mNeonGreen. Para L. tarentolae, após sete semanas de seleção, os parasitos apresentaram motilidade e morfologia alteradas (formas arredondadas) e um padrão de fluorescência puntiforme, não progredindo em cultura. A população de T. rangeli transfectada ainda em processo inicial de seleção, apresenta expressão puntiforme de mNeonGreen 48h após a transfecção. Com as primeiras passagens, observamos parasitos com morfologia, motilidade e padrões de divisão compatíveis com os parasitos selvagens, possuindo uma fluorescência em crescente intensidade. Os parasitos-controle transfectados com o plasmídeo base (FlagGPI_pROCK Neo), além de apresentarem os parâmetros biológicos semelhantes aos parasitos selvagens, apresentam uma fluorescência dispersa no citoplasma. Ensaios de Western blot utilizando um antissoro anti-quimera serão realizados com estas populações visando confirmar a expressão da quimera proteica.