Desenvolvimento de um kit de diagnóstico molecular point-of-care para COVID-19

Abstract

O SARS-CoV-2, o betacoronavírus causador da COVID-19, é o terceiro vírus da família Coronaviridae a causar surtos pandêmicos. A pandemia da doença COVID-19 foi avassaladora, resultando em mais de 6 milhões de óbitos mundialmente. Além disso, a pandemia prejudicou diversos setores médicos, como o do diagnóstico. A testagem correta de pacientes positivos permite o gerenciamento da crise sanitária como uma tentativa de contenção da pandemia a partir do isolamento social. Portanto, faz-se necessária o estabelecimento de metodologias que tornem o diagnóstico molecular acessível e Point-ofCare (PoC), visto que a técnica de RT-qPCR (método padrão ouro para diagnóstico de COVID-19) depende de recursos, laboratórios equipados e profissionais treinados. Propõe-se no presente estudo o desenvolvimento e validação de um kit de diagnóstico molecular, utilizando um cassete de extração de RNA viral desenvolvido pelo grupo, e através do ensaio isotérmico RT-LAMP com resultados colorimétricos visíveis a olho nu. Utilizando controle positivo de RNA viral sintético de SARS-CoV-2 foram descritos os Limites de Detecção (LD) do ensaio RT-LAMP colorimétrico e do kit com o cassete desenvolvido pelo grupo. Então, amostras clínicas, coletadas em conjunto com Estado de Santa Catarina através do LACENSC, de swab nasofaríngeo (SwN), swab naso/orofaríngeo (SwNO), saliva sem restrição (SR) e saliva em jejum (SJ) foram submetidas à extração de RNA por precipitação de álcool e no cassete, e posteriormente testadas com o ensaio isotérmico (RT-LAMP). A partir dos resultados, os valores de acurácia de diagnóstico e o coeficiente Kappa de Cohen foram descritos para cada grupo amostral. O LD experimental para o proposto kit é de 750 cópias/µl e o LD estatístico é de 320 cópias/µl. Foram coletadas e processadas 1.410 amostras divididas em seis grupos (1 a 6) distintos pelo local de coleta, tipo de material biológico e método de extração utilizado. Dentre os dados de acurácia, destacam-se os grupos amostrais 4 (composto de amostras SwNO extraídas com cassete) com sensibilidade de 95,83% (IC95%: 95,75 ? 99,49) e o grupo 6 (amostras de SJ extraídas com cassete) com sensibilidade de 85,71% (IC95%: 42,12 ? 99,63). A especificidade de todos os grupos amostrais testados foi acima de 97%. Os valores preditivos positivo e negativo do grupo amostral 6 foi 100% e 96,77% (IC95% 77,60 ? 99,14). O coeficiente Kappa de Cohen foi quase perfeito no grupo amostral 4, sendo 0,93. Os testes de diagnóstico apresentam janelas de detecção apropriadas para cada método, portanto, os ensaios moleculares são eficazes na detecção do RNA viral de infecções iniciais. Parte das amostras de saliva em jejum foram coletadas de pacientes internados pela enfermidade, permitindo estender o período de coleta. Assim, a análise de regressão probit de amostras positivas de COVID-19 demonstra o declínio da sensibilidade do oitavo ao 22º dia de sintomas. A carga viral média de amostras de SwN e saliva descrita na literatura é congruente com o LD das amostras positivas extraídas com o cassete, portanto o kit de extração em precipitação alcoólica com o cassete permite a detecção do material genético de SARS-CoV-2. Ao testar amostras clínicas, observa-se que amostras de SR apresentam valores de acurácia diagnóstica abaixo do desejado para testagem em massa. As amostras de SwN e SJ apresentam valores adequadas para aplicação de testagem em massa, enquanto as amostras de SwNO apresentam valores de sensibilidade e especificidade equiparáveis ao método de diagnóstico padrão ouro. Conclui-se que o método proposto de diagnóstico PoC para COVID19 apresenta valores de acurácia aplicáveis para diagnóstico em massa e locais com recursos limitados.

Abstract: The betacoronavirus SARS-CoV-2 is the third virus of the Coronaviridae family to cause pandemic outbreaks. The COVID-19 pandemic has caused over 6 million fatalities and has been overwhelming to different healthcare systems, including the diagnosis sector. A precise and early testing of positive patients is essential to manage the sanitary crisis with the recommendation of social distancing. Therefore, scientists have been researching for alternative methods to cheapen the costs of molecular diagnosis and use it as a Point-of-care testing. Such alternatives are in need, since the gold standard method is the RT-qPCR, it is a molecular assay that requires resources, equipped laboratories, and trained personnel. The present study develops and validates a molecular diagnosis kit for COVID-19. The kit is composed of a developed device to extract viral RNA and the isothermal essay RT-LAMP with colorimetric results visible to the naked eye. To describe the Limit of Detection (LoD) of the essay and the proposed kit was described using positive control dilutions. Furthermore, we analyzed clinical samples to describe the diagnostic accuracy parameters and Cohen?s Kappa. The experimental LoD from device extracted dilutions was 750 copies/µl, while the statistical LoD was 320 copies/ul. A total of 1,410 samples were tested and divided into six (1 ? 6) sampling groups by the extraction method used, biological material used and origin. The diagnostic accuracy data, such as sensibility was 92% (95% Confidence Interval (CI) 85,93- 96,75) for group 3 (naso/oropharyngeal swab extracted with alcohol precipitation), 95.83% (95%CI: 95.75?99.49) for group 4 (naso/oropharyngeal swab extracted with designed device), and 85.71% (95%CI: 42.12?99.63) for group 6 (early morning saliva extracted with designed device). The assay reports a specificity above of 97% for all sampling groups tested. The positive predictive values and the negative predictive value were 100% and 96.77% (95%CI: 77.60 ? 99.14), respectively, for group 6. The collection of hospitalized COVID-19 patients allowed the sampling of patients with more than eight days of presenting symptoms. The Cohen?s Kappa coefficient was almost perfect for groups 3, 4, and substantial for groups 1 (nasopharyngeal swabs extracted with alcohol precipitation) and 6. The probit regression analysis of the data showed that the diagnostic sensibility of the proposed method reduces from eight to 22 days of presenting symptoms. The LoD of the proposed diagnostic kit falls into range of the medium viral load of swab and saliva samples. The diagnostic accuracy data from the clinical samples resulted in a high specificity of the essay with both extraction methods. The naso/oropharyngeal samples analyzed resulted in values comparable to RTqPCR. The early morning saliva and nasopharyngeal swab samples were less effective; however, they fall into range for en massa testing. The indiscriminate saliva samples analysis resulted into low sensibility, probably due to no restriction of activities such as consumption of food, water, and dental hygiene. In conclusion, the proposed diagnostic kit presents successful data in diagnosing COVID-19 and the colorimetric RT-LAMP essay was comparable to RT-qPCR. The kit represents a low resource, low cost, simple, PoC method of diagnosing infectious diseases.