Análise de metabólitos secundários de nove espécies do gênero Polygala utilizando multiplataformas analíticas

Abstract

Considerando o potencial econômico dos metabólitos secundários, pesquisas têm focalizado diversas estratégias a fim de explorar e potencializar o enriquecimento desses metabólitos em matrizes vegetais em um contexto amplo. Ou seja, uma dessas estratégias é o desenvolvimento ou otimização de metodologias adequadas para a determinação, avaliação e quantificação desses metabólitos em plantas. Este estudo avaliou os constituintes químicos das espécies de Polygala pulchella, P. linoides, P. campestris, P. brasiliensis, P. sabulosa, P. paniculata, P. lancifolia, P. densiracemosa e P. altomontana utilizando as técnicas de Eletroforese Capilar de Zona com detecção no Ultravioleta-visível (CZE-UV), Cromatografia Líquida de alta eficiência com detecção no UV (HPLC-UV), Cromatografia Líquida com detecção por massas (LC-ESI-MS/MS), Ressonância Magnética Nuclear de 1H e análise in vitro da atividade antimicrobiana por microdiluição em caldo frente às bactérias com parede celular Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Escherichia coli (ATCC 25922). As espécies foram coletadas na região de Rancho Queimado e na ilha de Florianópolis. Após coleta das espécies, as amostras de extrato foram obtidas após total secagem do material botânico, seguido por extração com 5 ciclos de 7 dias em etanol 98% e posterior filtragem. O método desenvolvido utilizando CZE-UV foi validado e evidenciou a presença de ácido salicílico nas espécies de Polygala. O método utilizou de um eletrólito de fundo (BGE) de 15 mmol L-1 de hidroximetil-aminometano e 30 mmol L-1 de ácido 2-hidroxi-isobutírico, pH = 3,9. O método apresentou desempenho rápido, tempo de migração menor que 0,76 min para ácido salicílico e ftálico (padrão interno), resultados de precisão para área de pico foram melhores que 2,9% (intra-dia) e 2,8% (inter-dia) e as respostas para o os analitos foram lineares (intervalo de 1-5 mg L-1), com limites de detecção e quantificação de 0,2 e 0,6 mg L-1, respectivamente. O método analisou amostras de extratos Polygala, levando em conta as 9 espécies avaliadas, resultando em 4 extratos distintos para cada espécie (caule, raiz, folhas e flores), totalizando 39 amostras. Outro método utilizando CZE-UV foi desenvolvido com o objetivo de validar a autenticidade do perfil químico para espécies desse gênero. O método consiste na quantificação da 1,5dihidroxi-2,3-dimetoxi xantona e rutina em P. paniculata. O eletrólito para as separações foi composto por 30 mmol L-1 de tetraborato de sódio e 20% de MeOH em pH = 9,10. A separação foi realizada em um capilar de sílica fundida com comprimento total de 38,5 cm e diâmetro interno de 75 µm, com injeção de 50 mBar/30s pela extremidade mais distante do detector e detecção de UV a 280 nm. As respostas para os analitos foram lineares em uma faixa de 5-25 mg L-1, os limites de detecção foram 1,62 e 1,18 mg L-1 e os limites de quantificação foram 4,92 e 3,59 mg L-1 para Rutina e 1,5dihidroxi-2,3dimetoxi xantona, respectivamente. Uma amostra de extrato de Polygala paniculata foi analisada. Os resultados mostraram que 1,5dihidroxi-2,3-dimetoxi xantona e Rutina estavam presentes na amostra de extrato. Os constituintes fenólicos considerados marcadores químicos no gênero Polygala, como rutina, entre outros fenólicos foram determinados por LC-ESI-MS/MS e o preparo das amostras consistiu em diluição seguida da filtragem do extrato. A qualidade dos extratos de Polygala pôde ser avaliada de acordo com parâmetros e figuras de mérito analíticos, visando analisar os metabólitos bioativos, como flavonoides, cumarinas entre outros. As técnicas HPLC-UV e RMN de 1H foram as ferramentas escolhidas para avaliar as informações qualitativas dessas amostras. Os espectros de RMN de 1H dos extratos de Polygala permitiram uma análise qualitativa de parâmetros de qualidade dos diferentes perfis de composição química das espécies.. A avaliação da atividade antibacteriana frente às bactérias com parede celular S. aureus, P. aeruginosa e E. coli demonstrou atividade moderada para as espécies P. altomontana, P. sabulosa, P. campestres e P. paniculata. Os resultados demonstraram atividade dos extratos principalmente contra a bactéria Gram-positiva S. aureus CIM= 250-500 µg mL-1.

Abstract: Considering the economic potential of secondary metabolites, research has focused on several strategies in order to explore these metabolites in plant matrices in a broad context. In other words, one of these strategies is the development or optimization of suitable methodologies for the determination, evaluation and quantification of these metabolites in plants. This study evaluated chemical constituents of Polygala pulchella, P. linoides, P. campestris, P. brasiliensis, P. sabulosa, P. paniculata, P. lancifolia, P. densiracemosa and P. altomontana species using hyphenated techniques namely Capillary Electrophoresis coupled to a Visible Ultraviolet Detection Zone (CZE-UV), High Performance Liquid Chromatography coupled to a UV Detection (HPLC-UV), Liquid Chromatography coupled to a Mass Detection (LC-ESI-MS/MS), 1H Nuclear Magnetic Resonance and in vitro antimicrobial activity by broth microdilution against Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) and Escherichia coli (ATCC 25922) cell wall bacteria. The species were collected in the region of Rancho Queimado and on the island of Florianópolis. After collecting the species, extract samples were obtained after total drying of the botanical material, followed by extraction with 5 cycles of 7 days in 98% ethanol and subsequent filtration. The method developed using CZE-UV was validated and it evaluated the presence of salicylic acid in Polygala species. The method developed for eletrophoresis analysis, used a background electrolyte (BGE) of 15 mmol L-1 of hydroxymethyl-aminomethane and 30 mmol L-1 of 2-hydroxy-isobutyric acid, pH = 3.9. The method showed fast performance, migration time less than 0.76 min for salicylic and phthalic acid (internal standard), precision results for peak area were better than 2.9% (intraday) and 2.8% (inter-day) and responses to analytes were linear (range 1-5 mg L-1), with detection and quantification limits of 0.2 and 0.6 mg L-1, respectively. The method analyzed samples of Polygala extracts, considering that 9 species was studied, resulting 4 different extracts for each species (stem, root, leaves and flowers), leading to 39 sample extracts. Another method using CZE-UV was developed in order to validate the authenticity of the chemical profile for species of this genus. The method consists in the quantification of 1,5dihydroxy-2,3-dimethoxy xanthone and rutin in P. paniculata. The electrolyte for the separations consisted of 30 mmol L-1 of sodium tetraborate and 20% of MeOH at pH = 9.10. The separation was performed in a fused silica capillary with a total length of 38.5 cm and an internal diameter of 75 µm, with an injection of 50 mBar/30s at the far end of the detector and UV detection at 280 nm. Responses for analytes were linear over a range of 5-25 mg L-1, limits of detection were 1.62 and 1.18 mg L-1 and limits of quantification were 4.92 and 3.59 mg L-1 for Rutin and 1,5dihydroxy-2,3dimethoxyxanthone, respectively. The analysis of a sample of Polygala paniculata extract led to identification of 1,5-dihydroxy-2,3-dimethoxy xanthone and Rutin. Phenolic constituents present in the studied Polygala species such as rutin, among other phenolics were identified by LC-ESI-MS/MS analysis. The quality of Polygala extracts could be evaluated according to parameters and figures of analytical merit, aiming to identify the bioactive metabolites, such as flavonoids, coumarins, among others. The HPLC-UV and 1H NMR techniques were the tools chosen to evaluate the qualitative information of these samples. The 1H NMR spectra of Polygala extracts allowed a qualitative analysis for the quality parameters of the different chemical composition profiles of the species. The evaluation of antibacterial activity against bacteria with cell walls S. aureus, P. aeruginosa and E. coli showed the extracts of P. altomontana, P. sabulosa, P. campestres and P. paniculata showed moderate antibacterial activity mainly against the gram positive bacteria S. aureus with MIC values ranging 250-500 µg mL-1.