Estudo da biologia das células estromais mesenquimais de tecido adiposo canino

Abstract

As Células Estromais Mesenquimais (CEM) são células multipotentes e com potencial de autorrenovação com grande possibilidade de aplicação clínica veterinária. Estas células podem atuar regenerando diversos tecidos através da sua atividade parácrina e imunomoduladora. Neste sentido, o tecido adiposo canino constitui uma fonte importante de CEM pois pode ser facilmente coletado. As células obtidas possuem características de CEM sendo mais proliferativas quando comparadas às de outras fontes caninas. Porém, para uma melhor compreensão do seu potencial terapêutico é necessário compreender mais profundamente o comportamento destas células em cultivo e o estabelecimento de protocolos de isolamento, cultivo e expansão mais eficientes. Desta maneira, o objetivo deste estudo foi realizar a coleta, isolamento, cultivo, caracterização e análise da cinética, migração e danos genéticos de CEM derivadas de tecido adiposo canino (CEM-TAC) de um doador fêmea de oito meses de idade ao longo de três passagens celulares. O isolamento das CEM-TAC foi realizado por dissociação mecânica e enzimática do tecido adiposo abdominal proveniente de excedentes de cirurgia de castração. Após obtidas, as CEM-TAC foram mantidas sob condições de cultivo padrão e expandidas in vitro até a passagem 3 (P3). Amostras de células foram criopreservadas nas passagens 1 (P1) e 2 (P2). As CEM-TAC apresentaram, por microscopia de contraste de fase, a morfologia alongada e fusiforme característica das CEM in vitro, assim como a capacidade de adesão ao plástico. Em P3 começaram a apresentar aumento de tamanho e morfologia irregular, característico de células senescentes. Análises de citometria de fluxo para identificação de marcadores de superfície celular revelaram, de modo semelhante em P1 e P3, positividade para os marcadores mesenquimais e negatividade para os hematopoiéticos. O potencial migratório, avaliado pelo ensaio de fechamento de lesão in vitro das CEM-TAC demonstrou redução em P3 comparado às duas primeiras passagens. Foi observado ainda pela análise das curvas de crescimento e cálculo do Tempo de Duplicação Celular (CDT), redução da capacidade proliferativa das CEM-TAC com o aumento das passagens, acompanhado de aumento na frequência de células positivas para γ-H2AX, coerente com início do processo de senescência celular. Os resultados obtidos sugerem que as CEM-TAC sofrem com a redução da proliferação celular, alteração de morfologia e aumento da incidência de danos genéticos devido à expansão in vitro já em P3, porém suas características de célula-tronco mantem-se preservadas nas duas passagens mais iniciais.

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent and have a self-renewal potential, with great possibility for application in the veterinary clinics. These cells can act by promoting tissue repair through their paracrine and immunomodulatory activities. Canine adipose tissue is an important source of MSCs that can be easily collected. Cells obtained from canine adipose tissue are more proliferative than MSCs from other canine sources. However, for a better understanding of their therapeutic potential in dogs, it is necessary to understand more deeply their behavior in culture and to establish efficient protocols for isolation, cultivation, and expansion. Thus, this study aimed to isolate, to cultivate, to characterize and to evaluate the kinetics, migration, and genetic damage of MSCs derived from canine adipose tissue (MSCCAT) of an eight-month-old female donor over three cellular passages. Isolation was performed through the mechanical and enzymatic dissociation of adipose tissue and the MSC-CATs were maintained and expanded under standard culture conditions until passage 3 (P3). Cell samples were cryopreserved in passages 1 (P1) and 2 (P2). The MSC-CATs showed by phase contrast microscopy, the elongated and fusiform morphology characteristic of the MSCs, as well as the plastic adhesion ability. However, in P3 cells began to show the irregular and enlarged senescent morphology. Flow cytometry analyses revealed positivity for the mesenchymal markers and negativity for the hematopoietic ones similarly in P1 and P3. Scratch assay showed reduction in the migratory potential of MSC-CATs in P3 compared to P1 and P2. Reduction in the proliferative capacity with passages was also observed by growth curves analysis and calculation of Cell Doubling Time (CDT), accompanied by increased frequency of cells positives for γ-H2AX, consistent with the senescent process. Taken together, results suggest that MSC-CAT display reduced cell proliferation, morphological alterations, and increased incidence of genetic damage due to in vitro expansion already in P3, but their stem cell characteristics remain preserved in the two most initial passages.