Isolamento e caracterização de bacteriófagos da pecuária brasileira - ênfase em Santa Catarina

Abstract

A pecuária é uma atividade extremamente relevante economicamente no Brasil e para o mundo, sendo que o país encontra-se entre os principais produtores e exportadores mundiais de carne. Recentemente, observa-se um aumento no número de casos de surtos de doenças transmitidas por alimentos, sendo que entre os principais agentes etiológicos estão as bactérias da família Enterobacteriaceae, caracterizadas por serem Gram-negativas, não formadoras de esporos, anaeróbios facultativos, fermentadores de lactose e presentes no intestino de mamíferos. Devido ao frequente surgimento de novas cepas bacterianas com resistência aos antibióticos, se torna necessário o desenvolvimento de novas alternativas para o controle desses micro-organismos. Os bacteriófagos são vírus de procariotos, capazes de interagir no ciclo replicativo bacteriano, no seu controle e também na resistência microbiana. O seu conhecimento data do início do século XX, porém com o desenvolvimento dos antibióticos estudos usando fagos para controle sanitário ficaram em segundo plano, sendo estimado que apenas 0,0002% da diversidade global de bacteriófagos foi amostrada e estudada. Uma alternativa ao uso dos antibióticos são os coquetéis bacteriofágicos, os quais devem conter diversas espécies de bacteriófagos com capacidade lítica, podendo ou não possuir um amplo espectro infeccioso contra as bactérias. Este trabalho teve como objetivo buscar por bacteriófagos presentes em dejetos da pecuária brasileira, coletados em fazendas e granjas do Oeste do estado de Santa Catarina, que possuam capacidade lítica, compondo assim um biobanco, como possíveis alternativas contra enterobactérias de interesse no âmbito da saúde pública, que possa ser uma alternativa para aplicação na agroindústria, prezando pela saúde única (animal, humana e ambiental). Para isso, foram analisadas diferentes amostras de dejetos de granjas produtoras de aves, suínos e bovinos. Foi utilizado o método de duplo ágar para o isolamento dos bacteriófagos e o título viral foi determinado pelo cálculo de Unidades Formadoras de Placa, uma análise inicial para caracterização morfológica foi realizada por meio de microscopia eletrônica. Os isolados, devidamente filtrados e eluídos, foram avaliados molecularmente por sequenciamento de nova geração. As sequências foram avaliadas, sendo os genomas montados e analisados usando o programa Genome Detective. A predição e anotação gênica foi realizada com o software Prokka. A busca por genes de resistência foi realizada usando o programa CARD RGI. Resultados apontaram para o isolamento de 5 fagos com capacidade lítica em enterobactérias, sendo 3 com capacidade de infectar Salmonella enterica serovar Typhimurium, 1 Enterobacter aerogenes e 1 Klebsiella pneumoniae. Os dados obtidos através das montagens e predições dos genomas indicam que os fagos pertencem às famílias Siphoviridae e Myoviridae, sendo destaque o isolado KPSM1 (hospedeira K. pneumoniae) que apresentou 10 diferentes possíveis genes responsáveis pela resistência a diferentes classes de antibióticos. Esses dados demonstram a necessidade de explorar amostras provenientes da pecuária, a fim de buscar por bacteriófagos tanto para fins de biocontrole bacteriano, quanto para fins de estudos de resistências bacterianas mediadas por esses vírus, especialmente em bactérias com caráter zoonótico e ambiental.

Livestock is an extremely economically relevant area in Brazil and the world, the country is among the main producers and exporters of meat in the world. Recently, an increase in the number of cases of foodborne diseases has been observed, among the main etiological agents are the bacteria of the Enterobacteriaceae family, characterized by being Gram-negative, non-spore forming, facultative anaerobes, lactose fermenters and present in the intestine of mammals. Due to the frequent emergence of new antibiotic resistant bacterial strains, it is necessary to develop new alternatives to combat these microorganisms. Bacteriophages are prokaryotic viruses, capable of interacting with the bacterial replicative cycle, in its control and also in microbial resistance. Their knowledge dates back to the beginning of the 20th century, however, with the development of antibiotics, studies using phages for sanitary control were in the background, being estimated that only 0.0002% of the global diversity of bacteriophages was sampled and studied. An alternative to the use of antibiotics are bacteriophage cocktails, which must contain several species of bacteriophages with lytic capacity, which may or may not have a broad spectrum of infection against bacteria. This work aimed to search for bacteriophages present in Brazilian livestock waste, collected on farms in the West of the state of Santa Catarina, which have lytic capacity, thus composing a biobank, as possible alternatives against enterobacteria of interest in the scope of public health, which can be an alternative for application in the agroindustry, valuing the One-health approach (animal, human and environmental health). For this, different samples of manure from poultry, swine and cattle farms were analyzed. The double agar method was used for the isolation of bacteriophages and the viral titer was determined by the calculation of Plaque Forming Units, an initial analysis for morphological characterization was performed using electron microscopy. The isolates, properly filtered and eluted, were molecularly evaluated by next-generation sequencing. The sequences were evaluated, and the genomes were assembled and analyzed using the Genome Detective software. The prediction and gene annotation was performed with the Prokka. The search for resistance genes was performed using the CARD RGI software. Results pointed to the isolation of 5 phages with lytic capacity for enterobacterias, 3 with the capacity to infect Salmonella enterica serovar Typhimurium, 1 Enterobacter aerogenes and 1 Klebsiella pneumoniae. The data obtained through the assembly and predictions of the genomes indicate that the phages belong to the Siphoviridae and Myoviridae families, with emphasis on the isolate KPSM1 (host K. pneumoniae) that presented 10 different possibilities of genes responsible for resistance to different classes of antibiotics. These data demonstrate the need to explore livestock waste samples, in order to search for phages both for bacterial biocontrol purposes and for the purposes of phage-mediated bacterial resistance studies, especially in bacteria with zoonotic and environmental characteristics.