Desenvolvimento e avaliação das propriedades biofarmacêuticas e farmacológicas de nanopartículas de polieletrólitos constituídas de pranlintida e sulfato de dextrana com vistas a potencial aplicação para administração nasal no tratamento do Alzheimer

Abstract

A pranlintida (Pram) é um peptídeo análogo da amilina humana, aprovada pelo FDA para tratamento do diabetes mellitus (DM) dos tipos 1 e 2, em combinação com a insulina, e para tratamento da obesidade. Além disso, tem demonstrado efeitos promissores em diversos modelos de doença de Alzheimer (DA), no que parece agir como um antagonista funcional do receptor de amilina, revertendo danos causados por oligômeros tóxicos do peptídeo beta-amiloide (Aß). Em contraponto aos interessantes efeitos terapêuticos, suas propriedades farmacocinéticas compreendem curto tempo de meia-vida e rápida eliminação, após infusão intravenosa. A via de administração subcutânea, em esquema de múltiplas doses diárias também é um inconveniente para os pacientes. Com o intuito de contornar estes inconvenientes, este trabalho teve como objetivo desenvolver nanocarreadores para administração nasal da Pram e avaliar a sua potencial utlização no tratamento da DA. Inicialmente a complexação da Pram, catiônica em pH 4, com sulfato de dextrana (DexS), um polissacarídeo aniônico, foi utilizada para obtenção de nanopartículas de polieletrólitos (DexS/Pram NPs) com concentração de fármaco semelhante a presente no produto comercial, destinado a administração subcutânea (Symlin®). A adição de uma solução de Pram a uma solução de DexS, em uma estreita faixa de concentrações e razão molar, permitiu a obtenção de nanopartículas de polieletrólitos de tamanho nanométrico e com baixa dispersão de tamanho. A formação dos complexos ocorreu por interações eletrostáticas e ligações de hidrogênio espontâneas, além de interações hidrofóbicas, que levaram a modificações estruturais no peptídeo, permitindo sua estabilização na forma bioativa de a-hélice. Porém os complexos não foram estáveis em fluido nasal simulado (FNS), ocorrendo completa dissociação do fármaco. Algumas estratégias foram testadas para estabilização coloidal dos complexos, tendo a associação a superfície de gotículas de uma nanoemulsão demonstrado ser mais promissora, por não causar deslocamento da pranlintida dos complexos e não acrescentar componentes tóxicos à composição das nanopartículas. A permeação in vitro através da mucosa nasal suína foi avaliada utilizando células de difusão de Franz e FNS como meio aceptor. A permeação da Pram a partir das nanoemulsões revestidas pelos complexos (NEDexS/Pram) ocorreu de forma sustentada ao longo do tempo, e foi menor nas primeiras horas, enquanto a retenção na mucosa não foi afetada em relação ao peptídeo, administrado na forma de solução. Nos estudos de mucodifusão, a associação ao nanocarreador aumentou a difusão da Pram através de um gel fluido de mucina, o que foi atribuído às propriedades mucolíticas da DexS. Finalmente, os efeitos dos tratamentos com Pram livre ou associada ao nanocarreador (NEDexS/Pram), por via nasal, e da Pram livre por via intraperitoneal, na dose de 100 µg/kg/dia foram avaliados em estudos in vivo, utilizando modelo animal de DA induzido pela administração intracerebroventricular de oligômeros de Aß1-42. Nos testes comportamentais específicos para memória e cognição, o tratamento com NEDexS/Pram melhorou o desempenho dos animais, enquanto o tratamento com a solução de Pram, administrada por via nasal ou intraperitoneal, não modificou o desempenho dos animais em relação ao controle. Esses resultados estão de acordo com as propriedades esperadas para as nanoemulsões, que foram formuladas para manter a estabilidade da Pram nos fluidos biológicos e mucosa nasal, aumentar a área superficial de contato com a mucosa e promover sua difusão através da camada de muco. Estudos de biodistribuição e toxicidade crônica precisam ser realizados para afirmar os possíveis benefícios do fármaco nas formas livre e nanocarreado no tratamento da DA.

Abstract: Pramlintide (Pram) is a human amylin analog peptide, approved by the FDA for the treatment of diabetes mellitus (DM) types 1 and 2 in association with insulin, and obesity. Besides, Pram has demonstrated promising beneficial effects in several Alzheimer?s disease (AD) models, in what appears to act as a functional amylin receptor antagonist, reversing damage caused by toxic oligomers of the beta-amyloid (Aß) peptide oligomers. Despite its interesting therapeutic effects, Pram has a short half-life time and a fast elimination after intravenous injection. The subcutaneous administration, in a multiple-doses scheme, is also inconvenient for patients. To circumvent these drawbacks, this work aimed to develop Pram-loaded nanocarriers for nasal administration and to evaluate its potential application in the treatment of the DA. Firstly, the complexation of Pram, which is positively charged in pH 4.0, with dextran sulfate (DexS), an anionic polysaccharide, was used to obtain polyelectrolyte nanoparticles (DexS/Pram NPs), with a drug content similar to the subcutaneous formulation, marketed as Symlin®. The addition of a Pram solution to a DexS solution, in a narrow concentration and molar ratio range, allowed the formation of polyelectrolyte particles (DexS/Pram NPs) displaying nanometric size and narrow particle size distribution. The formation of the complexes occurred through electrostatic interactions and hydrogen bonds, in addition to hydrophobic interactions, which led to structural changes in the peptide, allowing its stabilization in the bioactive form of a-helix. Despite that, the complexes were not stable in simulated nasal electrolyte solution (SNES), occurring the complete dissociation of the drug. Some strategies were tested for colloidal stabilization of the complexes, and the association onto the droplet surface of a nanoemulsion (PEC-NEDexS/Pram) demonstrated to be promising, as it did not cause the displacement of the Pram after incubation of the complexes in SNES and did not add toxic components to the formulations. In vitro permeation of the Pram across porcine nasal mucosa was evaluated using Franz diffusion cells and SNES as acceptor medium. Pram permeation from the PEC-NEDexS/Pram occurred in a sustained manner over time, and was lower in the first hours, while the amount of Pram retained in the mucosa did not differ after the application of the free peptide or the PEC-NEDexS/Pram. In muco-diffusion studies, Pram association to the nanocarrier increased its diffusion across the mucin gel, which was attributed to the mucolytic properties of DexS. Finally, in vivo studies were carried out using the experimental model of AD induced by intracerebroventricular injection of Aß1-42 oligomers. The effects of intranasal treatment with Pram, free and associated with nanocarrier, at the dose of 100 µg/kg/day were evaluated. In the behavioral tests of memory and cognition, the treatment with the NEDexS/Pram improved the animal performance, while the treatment with the Pram solution by nasal or intraperitoneal routes did not alter the animal performance, regarding the control group. These results are in accordance with the expected nanoemulsion properties, which were developed to maintain Pram stability in biological fluids and nasal mucosa, enhance the surface contact area with the mucosa and promote the diffusion across the mucus layer. However, biodistribution and chronic toxicity studies must be performed to prove the beneficial properties of Pram, free and associated with the nanocarrier, in the AD treatment after nasal administration.