Análise do efeito de aril-ciclohexanonas monocarboxiladas sobre a resposta imune inata (in vitro)

Abstract

Os canabinóides tem se destacado dentre os compostos estudados com potencial efeito imunomodulador e contra afecções autoimunes e inflamatórias. Estes compostos químicos têm a capacidade de se ligar a receptores do sistema endocanabinóide promovendo as mais diversas ações farmacológicas. Eles podem ser denominados de endocanabinóides, quando produzidos endogenamente; fitocanabinóides, presentes naturalmente na planta Cannabis sp., e canabinóides sintéticos, quando obtidos sinteticamente, possuindo similaridade estrutural com os demais. Nesse contexto, dezenove diésteres de aril-ciclohexanonas e seus derivados, compostos sintetizadas com base no esqueleto aril-ciclohexano de fitocanabinóides, como o canabidiol (CBD), quanto à polarização, imunomodulação e potencial anti-inflamatório in vitro, utilizando a linhagem celular de macrófagos RAW 264.7. Como teste de triagem, foi realizada a verificação da viabilidade celular e citotoxicidade dos 19 compostos em estudo. Em seguida, calculou-se a CC10 de cada composto (concentração mínima necessária para matar 10% da população celular), utilizada como ponto de corte para o teste posterior, onde foi possível verificar a capacidade inibitória dos compostos sobre a produção de óxido nítrico (NO?). Sendo assim, os compostos que apresentaram efeito sobre este mediador inflamatório, ou seja, que inibiram 50% dos metabólitos do óxido nítrico quando comparados ao controle inflamado (LPS), foram submetidos aos testes de imunomodulação. A atividade anti-inflamatória dos compostos foi mesurada através da capacidade dos compostos em inibir a produção das citocinas pró-inflamatórias (IL-1ß, IL-6, IL-12p70, MCP-1, TNF-a, IFN-?) e aumentar a produção de citocinas anti-inflamatórias (IL-4, IL-10, IL-13). Diante do resultado apresentado frente a inibição ou produção das citocinas, o melhor composto foi selecionado. Com o composto final, foi avaliada a apoptose e fagocitose celular frente a macrófagos RAW 264.7. Além disso, verificou-se a expressão dos marcadores CD206 (receptor de manose), CD284 (receptor TLR4) e a capacidade do composto em reduzir a fosforilação da subunidade p65 do NF-?B. Os resultados do primeiro teste de triagem demonstraram que, dos dezenove compostos testados, apenas seis (compostos 1, 2, 4, 7, 10 e 11) não apresentaram citotoxicidade frente a linhagem celular estudada, e consequentemente, mostraram uma alta viabilidade celular. Quando submetidos ao teste do NO, apenas três compostos (1, 4 e 7) inibiram o mediador inflamatório de forma significativa. Avaliando-se a capacidade de reduzir as concentrações das citocinas pró-inflamatórias e aumentar a produção das citocinas anti-inflamatórias o composto 4 (1 µM) apresentou os melhores resultados. O composto também reduziu a apoptose celular de macrófagos, aumentou a expressão do marcador CD206 (receptor de manose) e ao mesmo tempo diminuiu a expressão de CD284 (receptor TLR4) na superfície destas células. O composto 4 aumentou a capacidade fagocítica dos macrófagos e inibiu significativamente a fosforilação da subunidade p65 da via NF-kB. Em conclusão, o composto 4, identificado como dietil-4-hidroxi-2-(4-metoxifenil)-4-metil-6-oxociclohexano-1-3-dicarboxilato, da classe de diésteres de aril-ciclohexanonas demonstrou um efeito anti-inflamatório significativo ao mesmo tempo que apresentou a capacidade de transformar fenotipicamente os macrófagos do fenótipo M1 (pró-inflamatório) para o fenótipo M2 (anti-inflamatório), levando-nos a hipotetizar que o principal mecanismo de ação anti-inflamatória desta molécula está ligado à sua capacidade de modulação imunológica.Os canabinóides tem se destacado dentre os compostos estudados com potencial efeito imunomodulador e contra afecções autoimunes e inflamatórias. Estes compostos químicos têm a capacidade de se ligar a receptores do sistema endocanabinóide promovendo as mais diversas ações farmacológicas. Eles podem ser denominados de endocanabinóides, quando produzidos endogenamente; fitocanabinóides, presentes naturalmente na planta Cannabis sp., e canabinóides sintéticos, quando obtidos sinteticamente, possuindo similaridade estrutural com os demais. Nesse contexto, dezenove diésteres de aril-ciclohexanonas e seus derivados, compostos sintetizadas com base no esqueleto aril-ciclohexano de fitocanabinóides, como o canabidiol (CBD), quanto à polarização, imunomodulação e potencial anti-inflamatório in vitro, utilizando a linhagem celular de macrófagos RAW 264.7. Como teste de triagem, foi realizada a verificação da viabilidade celular e citotoxicidade dos 19 compostos em estudo. Em seguida, calculou-se a CC10 de cada composto (concentração mínima necessária para matar 10% da população celular), utilizada como ponto de corte para o teste posterior, onde foi possível verificar a capacidade inibitória dos compostos sobre a produção de óxido nítrico (NO?). Sendo assim, os compostos que apresentaram efeito sobre este mediador inflamatório, ou seja, que inibiram 50% dos metabólitos do óxido nítrico quando comparados ao controle inflamado (LPS), foram submetidos aos testes de imunomodulação. A atividade anti-inflamatória dos compostos foi mesurada através da capacidade dos compostos em inibir a produção das citocinas pró-inflamatórias (IL-1ß, IL-6, IL-12p70, MCP-1, TNF-a, IFN-?) e aumentar a produção de citocinas anti-inflamatórias (IL-4, IL-10, IL-13). Diante do resultado apresentado frente a inibição ou produção das citocinas, o melhor composto foi selecionado. Com o composto final, foi avaliada a apoptose e fagocitose celular frente a macrófagos RAW 264.7. Além disso, verificou-se a expressão dos marcadores CD206 (receptor de manose), CD284 (receptor TLR4) e a capacidade do composto em reduzir a fosforilação da subunidade p65 do NF-?B. Os resultados do primeiro teste de triagem demonstraram que, dos dezenove compostos testados, apenas seis (compostos 1, 2, 4, 7, 10 e 11) não apresentaram citotoxicidade frente a linhagem celular estudada, e consequentemente, mostraram uma alta viabilidade celular. Quando submetidos ao teste do NO, apenas três compostos (1, 4 e 7) inibiram o mediador inflamatório de forma significativa. Avaliando-se a capacidade de reduzir as concentrações das citocinas pró-inflamatórias e aumentar a produção das citocinas anti-inflamatórias o composto 4 (1 µM) apresentou os melhores resultados. O composto também reduziu a apoptose celular de macrófagos, aumentou a expressão do marcador CD206 (receptor de manose) e ao mesmo tempo diminuiu a expressão de CD284 (receptor TLR4) na superfície destas células. O composto 4 aumentou a capacidade fagocítica dos macrófagos e inibiu significativamente a fosforilação da subunidade p65 da via NF-kB. Em conclusão, o composto 4, identificado como dietil-4-hidroxi-2-(4-metoxifenil)-4-metil-6-oxociclohexano-1-3-dicarboxilato, da classe de diésteres de aril-ciclohexanonas demonstrou um efeito anti-inflamatório significativo ao mesmo tempo que apresentou a capacidade de transformar fenotipicamente os macrófagos do fenótipo M1 (pró-inflamatório) para o fenótipo M2 (anti-inflamatório), levando-nos a hipotetizar que o principal mecanismo de ação anti-inflamatória desta molécula está ligado à sua capacidade de modulação imunológica.

Abstract: Cannabinoids have stood out among the compounds studied with a potential immunomodulatory effect and against autoimmune and inflammatory diseases. These chemical compounds have the ability to bind to receptors of the endocannabinoid system, promoting the most diverse pharmacological actions. They can be called endocannabinoids when produced endogenously; phytocannabinoids, naturally present in the Cannabis sp. plant, and synthetic cannabinoids, when obtained synthetically, having structural similarity with the others. In this context, nineteen aryl-cyclohexanones diesters and their derivatives, compounds synthesized based on the aryl-cyclohexane skeleton of phytocannabinoids, such as cannabidiol (CBD), regarding polarization, immunomodulation and anti-inflammatory potential in vitro, using the cell line of RAW 264.7 macrophages. As a screening test, the verification of cell viability and cytotoxicity of the 19 compounds under study was carried out. Then, the CC10 of each compound was calculated (minimum concentration necessary to kill 10% of the cell population), used as a cutoff point for the subsequent test, where it was possible to verify the inhibitory capacity of the compounds on the production of nitric oxide (NO?). Thus, the compounds that showed an effect on this inflammatory mediator, that is, that inhibited 50% of the nitric oxide metabolites when compared to the inflamed control (LPS), were submitted to immunomodulation tests. The anti-inflammatory activity of the compounds was measured through the ability of the compounds to inhibit the production of pro-inflammatory cytokines (IL-1ß, IL-6, IL-12p70, MCP-1, TNF-a, IFN-?) and increase the production of anti-inflammatory cytokines (IL-4, IL-10, IL-13). In view of the results presented regarding the inhibition or production of cytokines, the best compound was selected. With the final compound, cellular apoptosis and phagocytosis against RAW 264.7 macrophages were evaluated. Furthermore, the expression of the markers CD206 (mannose receptor), CD284 (TLR4 receptor) and the ability of the compound to reduce the phosphorylation of the p65 subunit of NF-?B were verified. The results of the first screening test showed that, of the nineteen compounds tested, only six (compounds 1, 2, 4, 7, 10 and 11) did not show cytotoxicity against the cell line studied, and consequently, showed high cell viability. When submitted to the NO test, only three compounds (1, 4 and 7) significantly inhibited the inflammatory mediator. Evaluating the ability to reduce the concentrations of pro-inflammatory cytokines and increase the production of anti-inflammatory cytokines, compound 4 (1 µM) showed the best results. The compound also reduced macrophage cell apoptosis, increased the expression of the marker CD206 (mannose receptor) and at the same time decreased the expression of CD284 (TLR4 receptor) on the surface of these cells. Compound 4 increased the phagocytic capacity of macrophages and significantly inhibited the phosphorylation of the p65 subunit of the NF-kB pathway. In conclusion, compound 4, identified as diethyl-4-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4-methyl-6-oxocyclohexane-1-3-dicarboxylate, from the class of aryl-cyclohexanones diesters demonstrated an anti- significant inflammatory while showing the ability to phenotypically transform macrophages from the M1 phenotype (pro-inflammatory) to the M2 phenotype (anti-inflammatory), leading us to hypothesize that the main mechanism of anti-inflammatory action of this molecule is linked to its immune modulation capacity.