Development of an enzymatic biosensor using organic-inorganic hybrids for detection of phenol

Abstract

Fenol, um poluente ambiental frequentemente encontrado em efluentes de indústrias químicas, é altamente tóxico mesmo em baixas concentrações. O presente estudo relata um método simples, rápido e de baixo impacto ambiental para biodetecção visual qualitativa de fenol usando nanoflores híbridas orgânico-inorgânicas de enzima horseradish peroxidase (HRP) com íons de cobre (Cu2+-hNF) e de cálcio (Ca2+-hNF). A enzima foi imobilizada pela técnica de automontagem da proteína em híbridos orgânico-inorgânicos, que na sequência foram suportados na superfície de uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). A eficiência da imobilização da enzima em estruturas híbridas foi comprovada pelas técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX), espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e difração de raios-X (XRD). A melhor concentração de proteína na síntese dos híbridos foi determinada como 0,25 mg.mL-1 para ambos os íons metálicos. A melhor temperatura e o melhor pH de uso encontrados foram 60 °C e 7,4, respectivamente, tanto para os híbridos quanto para a enzima livre, sugerindo que a imobilização não afetou as condições ótimas da HRP livre. A estabilidade térmica de 25 °C a 70 ºC e a estabilidade em pH de 4,0 a 9,0 dos híbridos também foram determinadas. Finalmente, ambos os biossensores produzidos em membrana de PVDF, usando híbridos de cobre e cálcio, foram capazes de detectar fenol em concentrações variando de 0,72 µmol.mL-1 a 24,00 µmol.mL-1 em 1 min de reação, enquanto biossensores de controle produzidos com quantidade equivalente de enzima livre não apresentaram mudança de cor perceptível nas mesmas condições. Os resultados sugerem uma aplicação promissora dos biossensores desenvolvidos na detecção de fenol.

Abstract: Phenol, an environmental pollutant frequently found in chemical industries effluents, is highly toxic even in low concentrations. This study reports a green, simple, and rapid method for visual qualitative phenol biosensing using horseradish peroxidase (HRP) hybrid nanoflowers made with copper (Cu2+-hNF) and calcium (Ca2+-hNF) ions. The enzyme was immobilized through protein-inorganic self-assembly into hybrid structures, subsequently supported onto a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The effective enzyme encapsulation into hybrid structures was sustained by scanning electron microscopy (SEM), energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), and powdered X-ray diffraction (XRD) techniques. The best protein concentration in hybrid synthesis was established as 0.25 mg.mL-1 for both metal ions. The best temperature and pH of use were found to be 60 °C and 7.4, respectively, for both hybrids and the free enzyme, suggesting that the immobilization did not affect the optimal conditions of the free HRP. Thermal stability from 25 °C to 70 ºC and pH stability from 4.0 to 9.0 of the hybrids were also determined. Finally, using copper and calcium hybrids, both biosensors produced onto a PVDF membrane could detect phenol in concentrations ranging from 0.72 µmol.mL-1 to 24.00 µmol.mL-1 within 1 min, whereas control biosensors produced with an equivalent amount of free enzyme have not presented a visible color change in the same conditions. The findings suggest a promising application of the developed biosensors in functional phenol detection.