Aplicação de um nanocarreador de RNAs de interferência (siRNA) contra a enzima glicogênio fosforilase para o tratamento da ceratite amebiana

Abstract

A ceratite amebiana (CA) é uma infecção da córnea grave, causada por amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba. A maioria dos casos são associados a usuários de lentes de contato e ao uso inadequado e má higiene das lentes e estojos de lente de contato. O trofozoíto é a forma ativa da ameba, que causa a infecção e o cisto é a forma de latência, de resistência. Os tratamentos atuais dependem da combinação de gluconato de clorexidina, isotionato de propamidina e poliaxametileno biguanida, porém são inespecíficos e inerentemente tóxicos. Atualmente são utilizadas formulações oftálmicas que visam a inativação dos cistos e trofozoítos de Acanthamoeba spp., mas são pouco efetivos contra os cistos, que levam a recorrência da infecção na maioria dos casos e prolongamento do tratamento. A enzima glicogênio fosforilase está envolvida na cascata de encistamento de Acanthamoeba spp., e a busca de inibidores da via de síntese dessa enzima, poderá impedir o encistamento das formas trofozoíiticas, que são mais suscetíveis a ação de fármacos. O presente trabalho teve por objetivo a aplicação de um sistema nanocarreador de pequenos RNAs de interferência (siRNA) para o silenciamento da glicogênio fosforilase no controle do encistamento de Acanthamoeba castellanii. Foram preparadas por emulsificação espontânea nanopartículas lipídicas, composta por 70% triglicerídeos de cadeia média (Mygliol 812N) e 30% de L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken Avanti®. A captação das nanopartículas internalizadas por trofozoítos foi observada por microscopia confocal. Os ensaios de atividade biológica foram realizados com a cepa Acanthamoeba castellanii (ATCC 50492). Os trofozoítos foram incubados com formulações com e sem siRNA em meio PYG e em meio de indução de encistamento (NEM) por 24, 48 e 96 horas, seguido de avaliação da viabilidade dos trofozoítos pelo ensaio do Alamar Blue® e contagem de cistos completos em hemocitômetro. A citotoxicidade da formulação foi avaliada utilizando células da córnea de coelho (SIRC ATCC ® – CCL 60). Os trofozoítos tratados com as formulações nanocarreadoras de siRNA foram submetidos a avaliação do grau de silenciamento gênico pela expressão do mRNA por PCR em tempo real. Os ensaios de microscopia confocal permitiram observar o sucesso no carreamento e internalização do nanocarreador de siRNA para o interior dos trofozoítos e localização no endossoma. Pelo ensaio do Alamar Blue® durante o período de tratamento dos trofozoítos por 24 horas, houve uma diminuição de 32% dos trofozoítos tratados com a nanoemulsão NE_glico quando comparada aos controles (CN e Mock). Foi avaliado o encistamento de trofozoítos após a incubação com nanoemulsão lipídica contendo siRNAs e observou-se a diminuição de até 31% na formação dos cistos após o tratamento com as formulações Naked_Glico e diminuição de 13% quando tratado com nanoemulsão NE_Glico por contagem de hemocitômetro. O sistema nanocarreador foi avaliado quanto ao perfil de citotoxicidade frente as células de córnea, que demonstrou baixo potencial citotóxico, com viabilidade celular >90%. A avaliação do grau de expressão gênica, feita através do método de qtPCR pode-se observar que quando comparado ao controle, houve diminuição de 36% para NK_glico e 20% para NE_glico. A aplicação de sistemas nanocarreador de pequenos RNAs de interferência avaliado mostrou-se efetivo para a incorporação do siRNA e silenciamento gênico e com baixo potencial citotóxico, apresentando-se promissor para aplicação de terapia gênica em casos de ceratite amebiana.