Padronização de métodos para estudos com o nematódeo Caenorhabditis elegans: enfoque em sistemas antioxidantes

Abstract

O Caenorhabditis elegans é um nematódeo com o hábito de vida livre. Por conta do ciclo de vida curto, genoma com grande homologia com humanos e facilidade na obtenção de cepas mutantes, sua utilização como modelo de pesquisa vem se tornando cada vez mais relevante. Dentre os genes homólogos entre C. elegans e mamíferos, estão os relacionados às defesas antioxidantes. Em destaque, está a glutationa (GSH), que é um tripeptídeo antioxidante com participação na manutenção do estado redox da célula. Além disso, a GSH é importante como cofator para a eliminação de peróxidos através da enzima glutationa peroxidase. Excesso de peróxidos causa distresse oxidativo, onde a quantidade de agentes oxidativos está acima da capacidade de eliminação da célula, e, por consequência, leva a danos oxidativos em biomoléculas. A capacidade para eliminar peróxidos é importante para a vitalidade celular. Tendo em vista o movimento no meio científico para reduzir a utilização de animais vertebrados nas pesquisas e a versatilidade do C. elegans como modelo de pesquisa, propusemos neste trabalho a padronização e adaptação de métodos referentes à otimização do manuseio e preparo de amostras, quantificação de tióis e peróxidos, além da verificação da compatibilidade de anticorpos com amostras de C. elegans através da técnica Western blot. Verificamos que a forma de centrifugação mais branda e eficaz para as lavagens entre tratamentos em microtubos é de 150 g por 15 segundos. Identificamos também que 4 sessões de sonicação de 10 segundos são suficientes para o rompimento completo dos vermes e obtenção de extratos proteicos com alta concentração. Testamos anticorpos contra peroxirredoxinas e tiorredoxinas, porém, nenhum dos anticorpos testados se mostrou específico para as proteínas de interesse. Padronizamos a técnica de detecção de peróxidos no meio de cultivo dos vermes. Foi possível acompanhar a degradação de peróxidos orgânicos com 100 a 500 vermes em 500 μL de meio e com 100 a 200 μM de peróxido de cumeno, cujo máximo de decaimento se ajusta a uma curva de decaimento de segunda ordem. Por fim, foi possível quantificar os níveis de tióis proteicos, tióis não proteicos e glutationa total em amostras de C. elegans. Em suma, estabelecemos com sucesso um método de sedimentação dos vermes e preparo de amostras de C. elegans. Estabelecemos as técnicas para quantificar a degradação in vivo de peróxidos pelos vermes e as condições para o ensaio de tióis solúveis (NPSH, GSH-t) e proteicos (PSH) em extrato ácido do verme. Podemos concluir que as metodologias foram eficazes em seus propósitos e abrem perspectivas de sua utilização em estudos científicos envolvendo o C. elegans, principalmente a respeito dos sistemas antioxidantes.

The Caenorhabditis elegans is a free-living nematode. Due to its short life cycle, high genome homology with humans, and facility in obtaining mutant strains, its use as a research model has become more relevant. Among the homologous genes between C. elegans and mammals, are those related to antioxidant defenses. Highlighted is glutathione (GSH), which is an antioxidant tripeptide with a role in the cell redox state maintenance. GSH is also important as a cofactor for the peroxide elimination through the enzyme glutathione peroxidase. Peroxides excess causes oxidative distress, where the amount of oxidative agents is higher than the cell’s elimination capacity, and, consequently, leads to oxidative damage in biomolecules. The ability to eliminate peroxides is important for cellular vitality. In view of the scientific community movement to reduce the vertebrate animals use in research and the C. elegans versatility as a research model, we proposed in this work the standardization and adaptation of methods related to the handling and samples preparation optimization, and thiols and peroxides quantification. In addition, we checked the antibody compatibility with C. elegans samples using the Western blot technique. We found that the mildest and most effective centrifugation for washing between treatments in microtubes is 150 g for 15 seconds. We also identified that 4 10-second sonication sessions are sufficient for the worms complete breaking to obtain a high concentration protein extract. We tested antibodies against peroxiredoxins and thioredoxins, however, none of the tested antibodies proved to be protein specific. It was possible to monitor the peroxides degradation with 100 to 500 worms in 500 μL of medium with cumene peroxide 100 to 200 μM, which the maximum peroxide decay adjusts to a second order decay curve. Finally, it was possible to quantify the protein thiols, non-protein thiols and total glutathione levels in C. elegans samples. In conclusion, we have successfully established a C. elegans sedimenting method and sample preparation. We established a technique to quantify the in vivo worm peroxide degradation and the conditions for testing soluble thiols (NPSH, GSH-t) and protein (PSH) in acidic worm extract. We can conclude that the methodologies were effective in their purposes and open perspectives for their use in scientific studies involving the C. elegans, mainly about antioxidant systems.