Investigação farmacológica em dor inflamatória da fração padronizada de polimetoxiflavonas de Ageratum conyzoides L. (Asteraceae) e avaliação farmacocinética do marcador 5'-metoxinobiletina

Abstract

Ageratum conyzoides é utilizada na medicina popular como analgésica e anti-inflamatória. Entre as substâncias de interesse identificadas nesta espécie estão as polimetoxiflavonas (PMF). Diante da necessidade do desenvolvimento de alternativas terapêuticas para o manejo de manifestações dolorosas e inflamatórias, este trabalho teve por objetivo obter e padronizar uma fração enriquecida em polimetoxiflavonas de A. conyzoides (FEPMF-Ac), avaliando sua efetividade farmacológica em modelos de nocicepção, assim como estabelecendo os parâmetros farmacocinéticos do marcador 5?-metoxinobiletina (5?-MeONB). A otimização das condições de extrações para a obtenção das PMF indicou como condições ideais o uso de n-hexano em aparato de Soxhlet. A otimização dos métodos de fracionamento cromatográfico do extrato bruto possibilitou a obtenção da FEPMF-Ac em apenas duas etapas de purificação, utilizando a cromatografia de partição centrífuga (CPC) como ferramenta inicial de enriquecimento da fração, seguida por filtração por cromatografia em coluna utilizando resina Sephadex® LH20 para a remoção das substâncias interferentes. A caracterização da FEPMF-Ac por UPLC-EM possibilitou a identificação de nove PMF, ageconiflavona C, 3'-hidroxi-5,6,7,8,4',5'-hexametoxiflavona, 7-hidroxi-5,6,8,5'-tetrametoxi-3',4'-metilenodioxiflavona, sinensetina, 5,6,7,3',4',5'-hexametoxiflavona, nobiletina, linderoflavona B, 5-MeONB e eupalestina. A quantificação do teor de PMF totais na FEPMF-Ac foi realizada em função de 5?-MeONB. A validação do método analítico desenvolvido em UPLC-EM demonstrou ser linear, exato e preciso para a quantificação deste marcador. Na investigação da atividade antinociceptiva em camundongos, utilizando o modelo de formalina, a FEPMF-Ac apresentou efeito antinociceptivo em diferentes doses, com maior inibição da nocicepção durante a fase inflamatória. Paralelamente, inibiu a nocicepção induzida por glutamato, bradicinina, histamina, assim como por substâncias ativadoras dos canais TRPV1 e ASIC e proteínas quinases C e A. Além disso, constatou-se que a 5?-MeONB contribui para este efeito desempenhado pela fração, visto que a mesma demonstrou atividade antinociceptiva. A biodisponibilidade oral em ratos foi de 8-11%. A compreensão dos parâmetros farmacocinéticos da 5?-MeONB contribui para o planejamento das próximas etapas incluídas no desenvolvimento de fármacos. Os resultados obtidos demonstram o potencial biológico das PMF de A. conyzoides para o alívio de quadros dolorosos inflamatórios.

Abstract: Ageratum conyzoides is used in folk medicine as an analgesic and anti-inflammatory. Among the substances of biological interest identified in this species are polymethoxyflavones (PMF). In order to develop therapeutic alternatives for the management of painful and inflammatory manifestations, this study aimed to obtain and standardize an enriched fraction of polymethoxyflavones from A. conyzoides (EFPMF-Ac), evaluating its pharmacological effectiveness in nociception models, as well as establishing the pharmacokinetic parameters of the fraction marker 5'-methoxynobiletin (5?-MeONB). Conditions for the extraction of the PMF were optimized, indicating the ideal conditions as n-hexane in Soxhlet apparatus. Optimization of chromatographic fractionation methods of the crude extract has enabled to obtain EFPMF-Ac in two purification steps, using centrifugal partition chromatography (CPC) as the initial enrichment tool, followed by column chromatography filtration using Sephadex® LH20 resin for the removal of interfering substances. Characterization of EFPMF-Ac by UPLC-MS enabled the identification of nine PMF, ageconyflavone C, 3'-hydroxy-5,6,7,8,4',5'-hexamethoxyflavone, 7-hydroxy-5,6,8,5'-tetramethoxy-3',4'-metilenedioxyflavone, sinensetin, 5,6,7,3',4',5'-hexamethoxyflavone, nobiletin, linderoflavone B, 5-MeONB and eupalestina. Quantification of total PMF content in the EFPMF-Ac was performed using the major substance 5?-MeONB as reference. Validation of the UPLC-MS analytical method developed has proved to be linear, accurate and precise for the quantification of 5'-MeONB. EFPMF-Ac has showed antinociceptive effect at different doses, in the investigation of antinociceptive activity in mice using formalin, with greater inhibition of nociception during the inflammatory phase. In addition, it has been effective by inhibiting nociception induced by glutamate, bradykinin, histamine, as well as activating substances of TRPV1 and ASIC channels and protein kinases C and A. Similarly, it was found that 5'-MeONB contributes to the effect of EFPMF-Ac, since it has demonstrated antinociceptive activity. Characterization of the pharmacokinetic parameters of 5'-MeONB revealed an oral bioavailability in rats of around 8-11%. The understanding of the pharmacokinetic parameters of the marker contributes to planning the next steps included in the development of drugs. Results obtained demonstrate the biological potential of PMF from A. conyzoides to relief painful inflammatory conditions.