Caracterização do perfil de citocinas e atividade da IDO em modelo de co-cultura in vitro e modelo ex vivo de tecido adiposo frente a estímulo inflamatório

Abstract

A obesidade é um problema de saúde mundial, relacionado a diversas comorbidades, incluindo a depressão. O triptofano é o precursor do neurotransmissor serotonina e perturbações nesta via metabólica podem levar ao surgimento de transtornos psiquiátricos. A enzima IDO é importante neste cenário, pois direciona o triptofano para a via das quinureninas e o aumento da concentração dos metabólitos desta via está associado à depressão. Esta enzima se encontra excessivamente ativada em quadros inflamatórios, como na inflamação crônica de baixo grau produzida pela obesidade. No entanto, a participação do tecido adiposo no aumento da atividade da IDO que se observa na obesidade não está elucidada, fazendo-se necessário o emprego de avaliações mais detalhadas sobre o tema. Neste sentido, os ensaios biológicos in vitro permitem a realização de análises mais convenientes e específicas em comparação a modelos in vivo ou estudos clínicos. Modelos de co-cultura celular têm sido utilizados como forma de mimetizar melhor as interações dos diferentes tipos celulares presentes em um tecido sem abrir mão das vantagens dos ensaios in vitro. Paralelamente, estudos com modelos ex vivo apresentam diversas das vantagens dos estudos in vitro e, ao mesmo tempo, a capacidade de simularem o que ocorre no tecido quando dentro do organismo. Diante deste cenário, foi estabelecido um modelo in vitro de co-cultura das linhagens murinas de adipócitos 3T3-L1 e macrófagos J774, a fim de caracterizá-lo quanto à capacidade de acumular lipídios, o perfil de liberação das citocinas IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a e adipocinas leptina e adiponectina e a atividade da IDO frente ao estímulo inflamatório com INF-?. Também se estabeleceram modelos ex vivo de tecido adiposo murino subcutâneo e visceral, avaliados quanto ao perfil de liberação das mesmas citocinas e à expressão do gene IDO1 frente ao mesmo estímulo inflamatório. Nenhum dos modelos apresentou concentrações detectáveis de TNF-a. O modelo de co-cultura não foi capaz de produzir adiponectina ou IL-10 e não sofreu influência do estímulo com INF-? na atividade da IDO ou na produção de IL-4 e leptina. No entanto, o modelo demonstrou ter capacidade de acumular lipídios intracelulares quando estimulado com meio de indução adipogênica e apresentou aumento da produção da citocina pró-inflamatória IL-6 (54,5 ± 42,2 ng/mL versus 208,0 ± 59,7 ng/mL, p < 0,05) frente ao estímulo inflamatório. Não foi possível detectar produção de IL-6 nos modelos ex vivo de tecido adiposo. O tecido adiposo subcutâneo apresentou menor concentração de leptina (1180 ng/mL versus 670 ng/mL, N = 1) quando estimulado com INF-? e ambos apresentaram concentração aparente da citocina anti-inflamatória IL-10 cerca de seis vezes menor sob o estímulo inflamatório (N = 1). Ainda, o tecido subcutâneo foi capaz de expressar IDO1, apresentando tendência de aumento da expressão relativa do gene em duas vezes e meia na presença de INF-?. Conclui-se que, diante da complexidade do tecido adiposo, o modelo de co-cultura apresenta limitações que impossibilitaram um estudo detalhado da IDO, mas pode ser utilizado para avaliação do acúmulo de lipídios e produção de IL-6. Os modelos ex vivo parecem ser adequados ao estudo da inflamação do tecido adiposo e ao estudo da via das quinureninas neste tecido, necessitando mais investigações para confirmar estas possibilidades.

Abstract: Obesity is a worldwide health issue, related to several comorbidities, including depression. Tryptophan is the precursor of the neurotransmitter serotonin, and disturbances in this metabolic pathway may lead to the development of psychiatric disorders. The enzyme IDO is essential in this scenario, as it directs the metabolism of tryptophan into the kynurenine pathway, and the increase in the levels of this pathway metabolites is tied to depression. This enzyme is excessively activated in inflammatory conditions, such as the chronic low-grade inflammation produced by obesity. However, the role of the adipose tissue in the observed increase of IDO activity in obesity is not clear, creating the need for more detailed evaluations on the topic. In this regard, in vitro biological assays allow the accomplishment of more convenient and specific assessments when compared to in vivo models or clinical assays. Co-culture models have been used as a way to better mimic the interactions between the different cell types within a tissue without giving up the benefits of in vitro assays. In parallel, studies with ex vivo models offer several of the advantages of in vitro studies and, at the same time, the capability to simulate what occurs in the tissue when inside the organism. In this scenario, we established an in vitro model of co-culture of the murine lines of 3T3-L1 adipocytes and J774 macrophages, to characterize it on the capability of lipid accumulation, IL-4, IL-6, IL-10 and TNF-a cytokines and leptin and adiponectin adipokines releasing profile, and IDO activity in front of the inflammatory stimulus with INF-?. We also established ex vivo models of subcutaneous and visceral adipose tissue, evaluated on the releasing profile of the same cytokines and the expression of IDO1 gene in front of the same inflammatory stimulus. No one of the models showed detectable levels of TNF-a. The co-culture model was unable to produce adiponectin or IL-10 and was not influenced by the stimulation with INF-? on IDO activity on IL-4 and leptin production. Nevertheless, the model showed to be capable of accumulating intracellular lipids when stimulated with adipogenic inducing medium and exhibited an increase in the pro-inflammatory IL-6 cytokine (54,5 ± 42,2 ng/mL versus 208,0 ± 59,7 ng/mL, p < 0,05) in the presence of the inflammatory stimulus. It was not possible to detect IL-6 production in the ex vivo adipose tissue models. The subcutaneous adipose tissue showed lower levels of leptin (1180 ng/mL versus 670 ng/mL, N = 1) when stimulated with INF-? and both tissues exhibited levels of the anti-inflammatory IL-10 cytokine around six times lower under the inflammatory stimulus (N = 1). Yet, the subcutaneous tissue was able to express IDO1, showing a tendency of increase of the relative expression of the gene of two and a half times in the presence of INF-?. We conclude that, in the face of the complexity of the adipose tissue, the co-culture model presents limitations that did not allow for a detailed study of IDO. Still, it can be used for the evaluation of lipid accumulation and IL-6 production. The ex vivo models might be suited for the study of adipose tissue inflammation and the study of the kynurenine pathway in this tissue, requiring further investigation to confirm these possibilities.