Determinação de monoftalatos em urina humana empregando a técnica de extração em ponteira descartável (DPX) E HPLC-DAD

Abstract

Nesse estudo, foi proposto a utilização da técnica de extração em ponteiras descartáveis (DPX) juntamente a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um detector por arranjo de diodos (HPLC-DAD) para a determinação de monoftalatos, um dos produtos de biotransformação dos ftalatos, em urina humana. Os produtos de biotransformação eleitos como analitos para serem estudados nesse trabalho foram o monometil ftalato (MMP), monobutil ftalato (MBP), monobenzil ftalato (MBzP) e mono-(2-etilhexil) ftalato (MEHP). As ponteiras utilizadas para realizar as extrações desses compostos, adquiridas comercialmente, possuem capacidade de 1 mL e contêm em seu interior 20 mg de material sorvente constituído de estireno-divinilbenzeno (DPX-RP), um material polimérico com características apolares. As otimizações dos principais parâmetros que afetam a eficiência do método proposto foram realizadas através de planejamentos experimentais univariados e multivariados. As amostras de urina foram diluídas a uma razão de 10 vezes em pH 2,0 e submetidas por 5 minutos à centrifugação a 3000 rpm. As condições ótimas do procedimento de extração foram 7 ciclos, cada um com 700 µL de amostra diluída de urina, seguido de uma etapa intermediária de lavagem do extrato composta por 2 ciclos com 300 µL de água ultrapura. Para a etapa de dessorção, a condição ótima foi obtida com 1 ciclo de 225 µL de acetonitrila. O método também passou por uma etapa de validação, no qual foi alcançado um bom desempenho analítico com coeficientes de correlação linear entre 0,9905 para o MMP e 0,9987 para o MBzP. Os limites de detecção (LOD) variaram entre 3,0 µg L-1 para o MBzP e 7,6 µg L-1 para os demais analitos, enquanto os limites de quantificação (LOQ) variaram entre 10 µg L-1 para o MBzP e 25 µg L-1 para os demais analitos. A precisão do método foi verificada por meio dos desvios padrões relativos (RSD%) de ensaios intradia (n=3) e interdia (n=9), enquanto a exatidão foi averiguada através de ensaios de recuperação relativa em amostras de urina de dois voluntários diferentes. As recuperações relativas variaram de 83% a 108% para a amostra 1 e entre 90% a 120% para amostra 2, a precisão intradia foi de 0,3% a 12,0% e a interdia entre 9,9% e 15,6%. O tempo total necessário para o procedimento de extração é cerca de 5 minutos para cada amostra e a corrida cromatográfica é de 20 minutos, o que pode ser caracterizado como um método rápido e eficiente para análises de monoftalatos em urina humana.

Abstract: In this study, it was proposed the use of disposable pipette extraction technique (DPX) with high performance liquid chromatography coupled to a diode array detection (HPLC-DAD) for the determination of monophthalates, one of the phthalate metabolites, in human urine. The phthalate metabolites elected as analytes to be studied in this work were the monomethyl phthalate (MMP), monobutyl phthalate (MBP), monobenzyl phthalate (MBzP) and mono-(2-ethylhexyl) phthalate (MEHP). The tips used to extract these compounds, commercially acquired, have a capacity of 1 mL and contain 20 mg of sorbent material compoused of styrene-divinylbenzene (DPX-RP), a polymeric material with nonpolar characteristics. The optimizations of the main parameters that affect the efficiency of the proposed method were performed through univariate and multivariate experimental designs. The urine samples were diluted 10 times in pH 2,0 and submitted for 5 minutes to centrifugation at 3000 rpm. The optimum conditions of the extraction procedure were 7 cycles, each with 700 µL of diluted urine sample, followed by an intermediate step of clean-up the extract consisting of 2 cycles with 300 µL of ultrapure water. For the desorption step, the optimal condition was obtained with 1 cycle of 225 µL of acetonitrile. The method also went through a validation step, in which a good analytical performance was achieved with linear correlation coefficients between 0,9905 for MMP and 0,9987 for MBzP. The limits of detection (LOD) varied between 3,0 µg L-1 for MBzP and 7,6 µg L-1 for the other analytes, while the limits of quantification (LOQ) ranged between 10 µg L-1 for MBzP and 25 µg L-1 for the other analytes. The precision of the method was verified by means of the relative standard deviations (RSD%) of intraday (n = 3) and interday (n = 9) tests, while the accuracy was verified through relative recovery tests on urine samples from two different volunteers. The relative recoveries ranged from 83% to 108% for sample 1 and between 90% to 120% for sample 2, the intraday precision was from 0,3% to 12,0% and the interday between 9,9% and 15,6%. The total time required for the extraction procedure is about 5 minutes for each sample and the chromatographic run is 20 minutes, which can be characterized as a fast and efficient method for analysis of monophthalates in human urine.