Análise do fenótipo das células neoplásicas em efusões pleurais por citometria de fluxo

Abstract

A efusão pleural (EP), também denominada de derrame pleural, é caracterizada pelo acúmulo de líquido no espaço pleural em decorrência do desequilíbrio entre a formação e a reabsorção de fluido, ou como consequência de uma alteração no sistema de drenagem linfática. De acordo com a etiologia e com base nos achados citológicos, as efusões pleurais podem ser classificadas em efusões pleurais reacionais (EPR), malignas (EPM) ou paramalignas (EPP). As EPM são definidas como o acúmulo de uma quantidade significativa de exsudato no espaço pleural, acompanhado da presença de células malignas ou tecido tumoral. A observação de células neoplásicas em amostras de efusão pleural por citologia é considerada o padrão ouro para o diagnóstico de EPM. Quando somente os achados morfológicos não são suficientes para definir o diagnóstico, a imunocitoquímica é a metodologia mais utilizada para auxiliar na sua conclusão. No entanto, apesar de ser a metodologia mais utilizada, possui algumas limitações, como a morosidade do procedimento e as variações interobservadores. Estudos mostram que a citometria de fluxo vem sendo utilizada como uma metodologia sensível, rápida e versátil para avaliar o imunofenótipo de células hematopoiéticas, pois é capaz de analisar um grande número de células marcadas com diferentes marcadores. Assim, o objetivo deste trabalho é avaliar o fenótipo das células presentes nos líquidos pleurais por citometria de fluxo e analisar a sua importância como marcadora fenotípica para o diagnóstico diferencial entre as efusões malignas e as benignas. Para isso, foram analisadas 58 amostras de líquido pleural utilizando avaliações morfológicas e/ou análises imunofenotípicas por citometria de fluxo e imunocitoquímica. Na definição do painel de anticorpos considerou-se os antígenos presentes nas células neoplásicas de pulmão (CK7, CK20, TTF-1, Ber-EP4), de mama (CK7, CK20, GCDFP-15) e nas neoplasias linfoproliferativas (Kappa e Lambda). Os resultados obtidos mostram que, na comparação entre as análises dos marcadores Lambda e Kappa por citometria de fluxo e imunocitoquímica (padrão ouro), houve uma concordância boa (teste de concordância Kappa indicou valor 0,767) e excelente (teste de concordância Kappa indicou valor 1,00), respectivamente, quando avaliados nas EPM de neoplasias linfoproliferativas. Conforme a análise da concordância entre as metodologias citadas acima, CK7 (teste de concordância Kappa indicou valor 0,750 ) e TTF-1 (teste de concordância Kappa indicou valor 0,545) foram melhores do que o Ber-EP4 (teste de concordância Kappa indicou valor 0,250) para as neoplasias não hematológicas. A análise de concordância Kappa para os marcadores GCDFP-15 e CK20 foi inviabilizada, pois foram poucos os casos que apresentaram a expressão desses marcadores celulares. Além disso, a análise dos valores relativos da população leucocitária não mostrou diferença estatística entre os grupos de pacientes avaliados (pacientes com EPR, EPM e EPP), com exceção do percentual médio de células NK em EPM de câncer de mama, que foi maior (6,20%) do que o percentual médio de células NK em EPM de câncer de pulmão (1,15%) (p-valor = 0,024). Os resultados deste estudo mostram que a citometria de fluxo pode ser uma ferramenta de diagnóstico laboratorial importante para detecção de células malignas em amostras de líquido pleural, e que em associação com a avaliação morfológica e imunocitoquímica pode auxiliar no diagnóstico diferencial das EPM. Isso implica na rapidez do diagnóstico e no aumento da eficiência dos tratamentos, o que pode resultar na diminuição do tempo de internação hospitalar e dos custos para o Sistema Único de Saúde (SUS) e na melhoria da qualidade de vida desses indivíduos.

Abstract: Pleural effusion (PE), also called pleural effusion, is characterized by the accumulation of fluid in the pleural space as a result of imbalance between fluid formation and resorption, or as a consequence of a change in the lymphatic drainage system. According to etiology and based on cytological findings, pleural effusions can be classified into reactive (RPE), malignant (EPM) or paramalignant (EPP) pleural effusions. SEM is defined as the accumulation of a significant amount of pleural space exudate, accompanied by the presence of malignant cells or tumor tissue. Observation of neoplastic cells in pleural effusion specimens by cytology is considered the gold standard for the diagnosis of EPM. When only morphological findings are not sufficient to define the diagnosis, immunocytochemistry is the most used methodology to assist in the conclusion of the diagnosis. However, despite being the most used methodology, it has some limitations, such as the length of the procedure and interobserver variations. Studies show that flow cytometry has been used as a sensitive, rapid and versatile methodology to evaluate hematopoietic cell immunophenotype, as it is able to analyze a large number of cells labeled with different markers. Thus, the objective of this study was to evaluate the phenotype of cells present in pleural fluids by flow cytometry and to analyze their importance as phenotypic markers for the differential diagnosis between malignant and benign effusions. For this, 58 pleural fluid samples were analyzed using morphological and / or immunophenotypic analyzes by flow cytometry and immunocytochemistry. Antibodies present in lung (CK7, CK20, TTF-1, Ber-EP4), breast (CK7, CK20, GCDFP-15) and lymphoproliferative (Kappa and Lambda) neoplasms were considered in the definition of the antibody panel). The results show that when comparing the analyzes of Lambda and Kappa markers by flow cytometry and immunocytochemistry (gold standard) there was a good agreement (Kappa agreement test indicated value 0.777) and excellent agreement (Kappa agreement test indicated value 1.00). ), respectively, when evaluated in MPM of lymphoproliferative neoplasms. The agreement analysis between the above methodologies for CK7 (Kappa agreement test indicated value 0.750) and TTF-1 (Kappa agreement test indicated value 0.545) was better than Ber-EP4 (Kappa agreement test indicated value 0.250) for non-hematologic malignancies. Kappa agreement analysis for GCDFP-15 and CK20 markers was unfeasible, as there were few cases that showed the expression of these cellular markers. In addition, the analysis of the relative values of the leukocyte population showed no statistical difference between the groups of patients evaluated (patients with RPE, EPM and EPP) except for the mean percentage of NK cells in breast cancer EPM that was higher (6, 20%) when compared to lung cancer cases (1.15%) (p-value = 0.024). The results of this study show that flow cytometry can be an important laboratory diagnostic tool for detection of malignant cells in pleural fluid samples, and that in association with morphological and immunocytochemical evaluation can assist in the differential diagnosis of PPE. This implies rapid diagnosis and increased treatment efficiency, which may result in shorter hospital stays, lower costs for the Unified Health System (SUS), and improved quality of life for these individuals.