Enzymatic process as a potential treatment technology to remove anticancer drugs from wastewater: laccase-assisted degradation of etoposide

Abstract

Introdução Fármacos vêm sendo detectados em concentrações cada vez mais elevadas em efluentes hospitalares, domésticos e industriais. Esses compostos podem chegar ao meio ambiente majoritariamente através de excreções humanas, podendo também ser provenientes do descarte inadequado de medicamentos. Essas substâncias são consideradas poluentes emergentes devido ao potencial de risco que apresentam ao meio ambiente e à saúde humana, sendo em sua maioria recalcitrantes aos processos convencionais de tratamento de efluentes. Estações de tratamento de efluentes são projetadas para a remoção de matéria orgânica facilmente ou moderadamente biodegradável, não se sabendo ao certo como as mesmas são afetadas pela presença de poluentes emergentes. Assim como outros fármacos, os citostáticos (quimioterápicos) também estão sendo detectados no meio ambiente, não apenas em águas residuárias, mas também em águas superficiais. Quimioterápicos possuem efeitos carcinogênicos, teratogênicos e citotóxicos mesmo em baixas concentrações. Esses medicamentos são usados no tratamento de câncer e, com a estimativa de aumento na incidência de câncer no mundo, há uma preocupação quanto o aumento da concentração dos mesmos em efluentes. Estudos utilizando fungos da podridão branca (WRF, do inglês ?White-rot Fungi?) na degradação desses fármacos vêm sendo realizados. Apesar de serem estudos relativamente novos, sem aplicações industriais, os mesmos afirmam que a maior parte do processo de degradação dos fungos é atribuída à ação de enzimas excretadas pelo mesmo. Dentre elas está a lacase, que nos estudos investigados é a que apresenta a maior atividade enzimática. Até o momento, não há estudos publicados utilizando a lacase na degradação de fármacos anticâncer, sendo o presente estudo inovador tanto para aplicação em tratamentos de efluentes, como para potenciais usos da enzima. Neste estudo, avaliou-se a capacidade de degradação do fármaco anticâncer etoposido pela lacase. Este fármaco apresenta vários riscos ecotoxicológicos, como por exemplo, danos no DNA do verme aquático Limnodrilus udekemianus e dos microcrustáceos Daphnia magna e Ceriodaphnia dubia em concentrações numa escala de µg·L-1. Dado o risco apresentado, decidiu-se avaliar à degradação do mesmo em concentrações próximas a encontrada em efluentes, avaliando-se as condições de processo que melhor se aplicam em um tratamento de efluentes. Objetivos O objetivo principal desta pesquisa é avaliar a degradação do fármaco etoposido pela enzima lacase proveniente de Trametes versicolor, determinando a melhor concentração enzimática, melhor condição de pH e o efeito da concentração do etoposido na velocidade inicial da reação, visando a aplicação em condições encontradas em tratamento de efluentes. Metodologia Os ensaios de degradação do etoposido pela lacase foram realizados em placas de 24 poços, contendo um volume reacional de 1 mL em cada poço, e posteriormente fechadas com filme selante de PCR para evitar evaporação. Todos os experimentos foram realizados em tampão fosfato 0,01 mol·L-1, tendo amostras de controle do fármaco em tampão para garantir que a degradação ocorreu apenas pelo processo enzimático. Os experimentos foram realizados em um agitador orbital a 180 rpm e 30 °C, com um tempo de reação de 6 horas. Durante as três primeiras horas, amostras de 0,8 mL foram retiradas a cada 20 minutos e, após esse tempo, retirou-se amostras a cada hora, sendo todas elas em duplicata. Para interromper a reação, adicionou-se 0,8 mL de acetonitrila fria nas amostras (1:1 v/v) e centrifugou-se as mesmas a 10000 rpm e 4 °C durante 10 minutos. Posteriormente as amostras foram congeladas para análises de cromatografia líquida (HPLC-UV). Visando-se a determinação da melhor concentração de enzima para a realização do processo, realizou-se a degradação do etoposido (500 µg·L-1) nas concentrações de lacase de 55, 110, 555 e 1100 U·L-1 em pH 6. Com o intuito de se observar a influência do pH, degradou-se o etoposido nos pHs 5, 6 e 7 em uma concentração enzimática de 55 U·L-1. Para avaliar o efeito da concentração de substrato, degradou-se o mesmo nas concentrações de 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 7000, 10000, 15000 e 18000 µg·L-1 em uma concentração enzimática de 55 U·L-1 e pH 6. A velocidade inicial da reação foi utilizada como variável resposta dos experimentos. Para quantificar-se a concentração do etoposido, utilizou-se a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLEA), tendo-se uma coluna C18 como fase estacionária, uma mistura acetonitrila:água (35/65) como fase móvel e um detector de absorbância UV. As amostras (20µL) previamente filtradas foram bombeadas pelo sistema com uma velocidade de 1.0 mL·min-1 e monitoradas a 254nm e 45°C. Uma curva padrão do etoposido em concentrações de 50 a 20000 µg·L-1 foi construída. Resultados A intenção de realizar a degradação em concentrações de µg·L-1 veio da necessidade de se aproximar ao máximo das concentrações em que o etoposido é encontrado em efluentes, dentro dos limites analíticos. Foi possível observar a degradação do etoposido em todas as condições testadas. Quanto à concentração de catalisador, observou-se que a maior concentração (1100 U·L-1) degradou 100% do substrato em uma hora. Já a menor concentração (55 U·L-1) atingiu 86% de degradação em 6 horas de reação. Observou-se que mesmo reduzindo 20 vezes a concentração de catalisador, a velocidade inicial da reação diminuiu em 50% e que dobrando a concentração do mesmo, há um aumento de 20 a 30% nessa velocidade, mostrando que não há necessidade de altas concentrações enzimáticas para realização do processo. Tendo em vista a futura aplicação, realizaram-se os experimentos posteriores utilizando-se a concentração de catalisador de 55 U·L-1. Quanto ao melhor pH para o processo, sabe-se que estações de tratamento de efluentes operam em condições próximas a neutralidade, porém que as enzimas provenientes de fungos geralmente possuem pHs ótimos ácidos. Como esperado, o pH 5 alcançou a maior velocidade inicial de degradação, atingindo 100% em 160 minutos de reação, enquanto os pHs 6 e 7 alcançaram aproximadamente 80% de degradação em 180 minutos. Comparando com o pH 5, os pHs 6 e 7 exibiram uma redução de 33 e 66% na velocidade inicial da reação, respectivamente. Mesmo não sendo o pH ótimo de degradação, o pH 6 foi utilizado nos experimentos futuros por possuir uma boa velocidade de degradação e estar próximo a torno da neutralidade. Quanto ao efeito da concentração de etoposido, observou-se uma relação linear entre a concentração do substrato e a velocidade inicial da reação, seguindo uma cinética de primeira ordem com uma constante K de 0,0477 min-1 (r2 = 0,995). Mesmo na maior concentração de etoposido testada (18000 µg·L-1), não se observou inibição da lacase pelo substrato, mostrando a viabilidade de aplicação mesmo em concentrações bem acima das encontradas em efluentes. Conclusões A revisão da literatura exibiu os riscos ambientais da ocorrência de drogas anticâncer em águas residuais e águas superficiais. Pesquisas utilizando fungos da podridão branca (WRF) mostraram o potencial de processos enzimáticos, especificamente a utilização da lacase, como um processo alternativo de degradação desses poluentes. Este estudo demonstrou que a degradação do etoposido é tecnicamente viável através de um sistema catalisado por lacase proveniente de Trametes versicolor. A degradação do substrato ocorreu em todas as condições de concentração do catalisador, pH e concentração de fármaco testados. Em resumo, mesmo em concentrações de etoposido na escala mg·L-1, não ocorreu inibição da lacase pelo substrato, sendo escolhida a condição de pH 6, 55 U·L-1 e 30 ° C como a que exibiu o melhor resultado para a aplicação desejada, ocorrendo em pH em torno da neutralidade. Avaliou-se também o efeito do aumento da concentração de etoposido, tendo-se observado comportamento linear entre a concentração do fármaco e a velocidade inicial da reação, possuindo uma cinética de primeira ordem.<br>

Abstract: Anticancer drugs exhibited recalcitrant behavior to conventional wastewater treatments and have been found in domestic, industrial, and hospital wastewater. They present environmental risks, as well as cytotoxic and carcinogenic effects in higher organisms, even at low concentrations. Studies were developed looking for new processes to meet this demand, among them, biological treatments using white-rot fungi (WRF), with degradations attributed mainly to laccase activity. Laccase was tested in etoposide anticancer drug degradation. Tests were carried out with 55, 110, 555, and 1100 U·L-1 of laccase activity, and, in all of them, the etoposide degradation was achieved. The pH conditions were also varied, using pH 5, 6, and 7. The highest initial reaction rate was obtained at pH 5; however, pH 6 was chosen due to application in environmental conditions (pH around neutrality). Etoposide concentration variations were performed in the range of 500-18000 µg·L-1 and exhibited a linear behavior with an increasing initial reaction rate, with degradation kinetics of 0.0477 min-1 (r2 = 0.995).