Modulação da expressão gênica das proteínas ligantes ao RNA de dupla-fita (DRBs) em Arabidopsis thaliana durante infecção fúngica

Abstract

As proteínas do domínio de ligação a RNA dupla fita (dsRBPs) foram caracterizadas em eucariotos e procariotos e estão envolvidas em todos os aspectos da biologia do RNA, incluindo síntese, transporte, processamento, tradução e degradação. O genoma de Arabidopsis thaliana codifica cinco proteínas ligantes à RNA dupla fita (DRB), uma família de dsRBPs, denominadas DRB1 a DRB5. As DRBs são caracterizadas por dois domínios de ligação a RNA dupla fita na extremidade N-terminal e estão envolvidas na biogênese de pequenos RNAs, especialmente na via de microRNAs (miRNAs) e trans-acting siRNAs (tasiRNAs). Estudos anteriores mostraram que algumas proteínas DRBs estão envolvidas em respostas a infecções virais e bacterianas. DRB3 participa da defesa mediada pela metilação de DNA contra vírus, enquanto DRB4 altera sua localização subcelular para interagir com o RNA viral, controlando a infecção. Além disso, DRB4 também participa de mecanismos de resistência durante doenças bacterianas. No entanto, as DRBs não foram exploradas durante respostas a doenças fúngicas. Os fungos desempenham um papel dominante entre os fitopatógenos, causando epidemias devastadoras para as espécies vegetais e são classificados pelo estilo de vida como necrotróficos, biotróficos e hemibiotróficos. Por esse motivo, esse estudo tem como objetivo investigar o possível envolvimento de DRBs em A. thaliana infectada pelo fungo necrotrófico Alternaria brassicicola e pelo fungo hemibiotrófico Colletotrichum higginsianum. Analisamos a expressão gênica de DRBs e miRNAs do ecótipo A. thaliana Col-0 após a inoculação com a cepa CBS 125088 de A. brassicicola e cepa IMI 349063 de C. higginsianum. As plantas foram cultivadas em câmaras de crescimento e as folhas de plantas adultas de três replicatas biológicas foram coletadas dos grupos infectados e controle às 6, 12, 24 e 48 horas após a inoculação. O RNA total foi extraído e a transcrição reversa foi realizada posteriormente. Foi realizada PCR quantitativa e, para a análise de expressão relativa, utilizou-se Actina e Ubiquitina como genes de referência. Em plantas infectadas com A. brassicicola, também foi analisada a expressão dos genes de miRNAs MIR164, MIR169 e MIR172, usando MIR159 e MIR396 como genes de referência. Os resultados demonstram que DRB1, DRB3, DRB4 e DRB5 foram expressos diferencialmente entre plantas infectadas e controle em alguns pontos da avaliação durante a infecção por A. brassicicola, e DRB3, DRB4 e DRB5 foram modulados durante a infecção por C. higginsianum. Além disso, também foi encontrada modulação na expressão dos genes MIR169 e MIR172 durante a infecção por A. brassicicola. Os resultados obtidos sugerem que DRB3 e DRB4 são bons candidatos a serem explorados durante infecções fúngicas, uma vez que já foi demonstrada sua participação em mecanismos de defesa de plantas. Além disso, DRB5 foi expresso diferencialmente em ambos os patossistemas, o que pode representar uma nova função para essa proteína, visto que sua função ainda permanece indefinida.

Abstract: The Double-stranded RNA binding domain proteins (dsRBPs) were characterized in eukaryotes and prokaryotes and are involved in all aspects of RNA biology, including synthesis, transport, processing, translation and degradation. Arabidopsis thaliana genome encodes five Double-stranded RNA binding (DRB) proteins, a family of dsRBPs, denominated from DRB1 to DRB5. The DRBs are characterized by two double stranded RNA binding domains at the N-terminal end and are involved in the biogenesis of small RNAs, especially in the pathway of microRNAs (miRNAs) and trans-acting siRNA (tasiRNAs). Previous studies have shown that some DRBs proteins are involved in responses to viral and bacterial infection. DRB3 participates in methylation-mediated defense against DNA viruses, while DRB4 alters its subcellular location to interact with viral RNA, controlling infection. Besides that, DRB4 is also required by resistance mechanisms during bacterial disease. However, the DRBs were not explored during fungal diseases. Fungi play a dominant role among phytopathogens causing devastating epidemics for plant species and are classified by their lifestyle as necrotrophic, biotrophic and hemibiotrophic. For this reason, this study aims to investigate the possible involvement of DRBs in A. thaliana infected by the necrotrophic fungus Alternaria brassicicola and by the hemibiotrophic fungus Colletotrichum higginsianum. We analyzed the gene expression of the DRBs and some miRNAs from A. thaliana ecotype Col-0 after the inoculation with the A. brassicicola strain CBS 125088 and C. higginsianum strain IMI 349063. Plants were cultivated in growth chambers and leaves of adult plants from three biological replicates were collected from infected and control groups after 6, 12, 24 and 48 hours of the inoculation. Total RNA was extracted and the reverse transcription was subsequently carried out. The relative expression was analysed employing Actin and Ubiquitin as reference genes. In plants infected with A. brassicicola, were also analyzed the expression of the miRNA genes MIR164, MIR169 and MIR172, using MIR159 and MIR396 as reference genes. Results showed that DRB1, DRB3, DRB4 and DRB5 were differentially expressed between infected and control plants in some evaluation points during A. brassicicola infection, and DRB3, DRB4 and DRB5 were modulated during C. higginsianum infection. Besides that, a modulation was found in the MIR169 and MIR172 gene expression during A. brassicicola infection. The results suggest that DRB3 and DRB4 are good candidates to be explored during fungal diseases, since they have already been demonstrated to participate in plant defense mechanisms. In addition, DRB5 was differentially expressed in both pathosystems, which may represent a new function for this protein, since its role is still undefined.