Neurotoxicidade induzida pela exposição ao piriproxifeno durante o desenvolvimento embrionário de Gallus domesticus

Abstract

O piriproxifeno (PPF) (C 20 H 19 NO 3 ) é um larvicida a base de piridina que atua como um regulador de crescimento de insetos. No Brasil desde o ano de 2014, o larvicida PPF vem sendo aplicado em reservatórios de água potável para o controle da proliferação do mosquito do gênero Aedes, vetor das doenças Dengue, Chikungunya e do Zíka vírus. Desde então, observou- se o aumento dos casos de microcefalia em recém-nascidos no país, sendo que instituições de saúde publicaram notas técnicas alertando sobre a possível associação entre esses casos e o larvicida aplicado em reservatórios de água potável. Com o objetivo de investigar os efeitos neurotóxicos do PPF, este trabalho caracterizou a morfologia e os eventos celulares envolvidos na histogênese das camadas celulares das vesículas encefálicas no encéfalo após a exposição ao PPF, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo experimental. Para tal, concentrações sub-letais do PPF (0,01 mg/L e 10 mg/L diluídas em DMSO e salina a 0,9%) foram definidas por uma curva de sobrevivência e testadas para avaliação toxicidade. A exposição ao PPF foi realizada in ovo após 24 h de incubação, que corresponde à idade embrionária (E1), sendo os embriões analisados em E10. Embriões não expostos ao PPF foram utilizados como controle. Inicialmente, as análises morfométricas indicaram redução significativa na massa corporal do embrião e do encéfalo nos grupos expostos ao PPF. Foram realizadas medidas externas da região cefálica e, os embriões expostos à concentração de 10 mg/L de PPF apresentaram redução significativa nas medidas da distância ântero-posterior e da distância transversal da cabeça. Nas medidas do encéfalo, os embriões expostos à concentração de 10 mg/L de PPF apresentaram redução significativa na largura do encéfalo. Quando realizadas morfometrias internas das vesículas encefálicas, os grupos expostos ao PPF apresentaram redução da largura e altura do telencéfalo. Também, foram observadas reduções significativas na largura total do mesencéfalo acompanhado de reduções na espessura da região rostral, região caudal e no teto mesencefálico. Nas morfometrias das camadas celulares do telencéfalo, os grupos expostos às duas concentrações de PPF apresentaram redução significativa na espessura e na densidade numérica de células por área (NA) das camadas ependimária e cortical. As camadas celulares do mesencéfalo nos grupos expostos às duas concentrações de PPF apresentaram redução significativa na camada epêndimária e nas camadas I, IV e V, VI, VII e X. Adicionalmente, a NA no mesencéfalo também reduziu significativamente na camada epêndimária e nas camadas I, VI, VII, VIII, IX e X. Não se observou redução significativa na viabilidade celular no encéfalo, tampouco aumento dos centros de ossificação na cabeça. No grupo exposto à concentração de 10 mg/L de PPF observou-se redução na proliferação celular (marcador Fosfo-histona H3) e aumento no dano ao DNA (marcador ?-H2A.X). Não se observou redução na diferenciação neuronal (marcador ß3 Tubulina) e diferenciação glial (marcador GFAP). Não se observou alteração no número de células positivas para a proteína Caspase 3, efetora de apoptose. Por outro lado, o número de células apoptóticas pela análise da fragmentação do DNA aumentou significativamente no grupo exposto à concentração de 10 mg/L. Os resultados demonstraram que a exposição in ovo, com destaque para a concentração de 10 mg/L, induziu alterações morfométricas, densidade celular e conteúdo de proteínas, comprometendo o desenvolvimento do encéfalo.

Abstract: Pyriproxifen (PPF) (C 20 H 19 NO 3 ) is a pyridine-based larvicide that acts as an insect growth regulator. In Brazil, since 2014, the PPF larvicide has been applied in drinking water reservoirs to control mosquito proliferation of the genus Aedes, a vector of the diseases Dengue, Chikungunya and Zíka virus. Since then, there has been an increase in cases of microcephaly in newborns in the country, and health institutions have published technical notes warning about the possible association between these cases and larvicide applied in drinking water reservoirs. In order to investigate the neurotoxic effects of PPF, this work characterized the morphology and cellular events involved in the histogenesis of the cell layers of the brain vesicles in the brain after exposure to PPF, using Gallus domesticus embryos as an experimental model. For this, the sub lethal PPF concentrations (0.01 mg/L and 10 mg/L diluted in DMSO and 0.9% saline) were defined by a survival curve and tested for evaluation of toxicity. PPF exposure was performed in ovo after 24 hours of incubation, which corresponds to the embryonic age (E1), and the embryos were analyzed in E10. Embryos not exposed to PPF were used as controls. Initially, morphometric analysis indicated a significant reduction in embryo and brain mass in groups exposed to PPF. External measurements of the cephalic region were performed, and embryos exposed to a concentration of 10 mg/L of PPF showed a significant reduction in the measurements of the anteroposterior distance and the transversal distance of the head. In brain measurements, embryos exposed to a concentration of 10 mg/L of PPF showed a significant reduction in brain width. When internal morphometries of the brain vesicles were performed, the groups exposed to PPF showed a reduction in the width and height of the telencephalon. Significant reductions in the mesencephalon total width were also observed, accompanied by reductions in the thickness of the rostral region, caudal region and in the mesencephalic tectum. In the morphometries of the cell layers of the telencephalon, the groups exposed to the two concentrations of PPF showed a significant reduction in the thickness and in the numerical density of cells by area (NA) of the ependymal and cortical layers. The mesencephalon cell layers in the groups exposed to the two PPF concentrations showed a significant reduction in the ependymal layer and in I, IV and V, VI, VII and X layers. In addition, NA in the mesencephalon also decreased significantly in the ependymal layer and in I, VI, VII, VIII, IX and X layers. There was no significant reduction in cell viability in the brain, neither an increase in ossification centers in the head. In the group exposed to the concentration of 10 mg/L of PPF, a reduction in cell proliferation (Phospho-histone H3 marker) and an increase in DNA damage (?-H2A.X marker) were observed. There was no reduction in neuronal differentiation (ß3 Tubulin marker) and glial differentiation (GFAP marker). There was no change in the cells positive number for Caspase 3 protein, effective for apoptosis. On the other hand, the number of apoptotic cells through DNA fragmentation analysis increased significantly in the group exposed to the concentration of 10 mg/L. The results showed that in ovo exposure, with emphasis on the concentration of 10 mg/L, induced morphometric changes, cell density and protein content, compromising brain development.