Identificação e perfil transcricional de genes envolvidos no controle de qualidade mitocondrial em diferentes estágios do desenvolvimento embrionário do camarão de água doce Macrobrachium olfersii: efeito da radiação UVB na indução à mitofagia

Abstract

O aumento da incidência de radiação ultravioleta B (UVB) na superfície terrestre está intimamente relacionado à rarefação da camada de ozônio. A energia desta radiação é capaz de causar diferentes respostas em adultos, larvas e embriões de organismos de ambientes terrestres e aquáticos. Macrobrachium olfersii é um camarão de água doce que vive e se reproduz em água claras e rasas, onde a radiação UVB penetra facilmente. As fêmeas transportam os ovos em uma câmara incubadora ventral e externa, de modo que os ovos estão expostos à radiação UVB durante o desenvolvimento embrionário. Considerando a premissa de que os embriões são mais suscetíveis à estressores do que larvas e adultos, e ainda que as mitocôndrias das células embrionárias dessa espécie de camarão são um alvo importante da radiação UVB. O objetivo desse estudo foi caracterizar as sequências codificantes dos genes relacionados à mitofagia em embriões de M. olfersii, bem como, quantificar os níveis de transcritos dos genes ao longo do desenvolvimento embrionário e a após a exposição à radiação UVB. A partir do transcriptoma dos embriões de M. olfersii, foi realizada a identificação das sequências codificantes dos genes relacionados à mitofagia PINK1, PRKN, SQSTM1 e MAP1LC3, e dos genes responsáveis pela produção de proteínas presentes nas membranas mitocondriais externa e interna, TOMM2O e OPA1, respectivamente. A reconstrução filogenética demonstrou caráter conservado dessas sequências, quando comparado com outras espécies de crustáceos e organismos modelos em estudos de biologia do desenvolvimento. Os resultados obtidos através da RT-qPCR demonstraram que os genes analisados são altamente regulados ao longo do desenvolvimento, aumentando seus níveis próximos à eclosão. Já a quantificação dos transcritos desses mesmos genes em embriões expostos à radiação UVB demonstrou um aumento significativo 6h após a exposição à radiação UVB. A quantificação por imuno-histoquímica das células positivas para a proteína indutora de mitofagia (PINK1), para a proteína de autofagossoma (LC3B), e para a proteína de membrana externa mitocondrial (TOM20) demonstrou aumento significativo 12h após a exposição à radiação UVB. Considerando esses resultados, concluímos que após o aumento dos níveis de transcritos dos genes 6h após a exposição a UVB, ocorre a tradução dos mRNA em proteínas, o que é compatível com os resultados do aumento no número de células positivas para PINK1, LC3B e TOM20 12h após à exposição. Este estudo evidencia que a mitofagia é inerente ao desenvolvimento embrionário de M. olfersii, e que pode ser ativada pela exposição à radiação UVB. Dados obtidos contribuem para a compreensão da mitofagia em células embrionárias de invertebrados aquáticos e ainda para o conhecimento atual sobre o impacto da radiação UVB nesses organismos. Diante dos resultados obtidos, propõe-se a identificação de mitofagia como um biomarcador de exposição à radiação UVB.<br>

Abstract: The increase in the incidence of ultraviolet B (UVB) radiation on the Earth's surface is closely related to rarefaction of the ozone layer. The energy of this radiation is capable of causing different responses in adults, larvae and embryos of organisms from terrestrial and aquatic environments. Macrobrachium olfersii is a freshwater prawn that lives and reproduces in clear and shallow water, where UVB radiation penetrates easily. Females carry the eggs in a ventral and external brood pouch, and the eggs are exposed to UVB radiation during embryonic development. Considering the premise that embryos are more susceptible to stressors than larvae and adults, and also that the mitochondria of embryonic cells of this prawn species are an important target of UVB radiation. The aim of this study was to characterize the coding sequences of related genes to mitophagy in M. olfersii embryos, as well as to quantify transcript levels of the genes during embryonic development and after exposure to UVB radiation. Identification of the coding sequences of genes related to mitophagy PINK1, PRKN, SQSTM1 and MAP1LC3, and the genes responsible for the production of proteins present in the outer and inner mitochondrial membranes, TOMM2O and OPA1, respectively, were identified from the transcriptome of the M. olfersii embryos. Phylogenetic reconstruction demonstrated conserved character of these sequences when compared to other species of crustaceans and model organisms in developmental biology studies. The results obtained through RT-qPCR demonstrated that the genes analyzed are highly regulated throughout development, increasing their levels close to hatching. The quantification of the transcripts of these same genes in embryos exposed to UVB radiation demonstrated a significant increase 6h after exposure to UVB radiation. The quantification by immunohistochemistry of cells positive for mitophagy-inducing protein (PINK1), autophagosome protein (LC3B), and mitochondrial outer membrane protein (TOM20) demonstrated a significant increase 12h after exposure to UVB radiation. Considering these results, we conclude that after the increase of transcript levels of genes 6h after UVB exposure, mARN translation into proteins occurs, which is compatible with the results of the increase in the number of cells positive for PINK1, LC3B and TOM20 12h after exposure. This study shows that mitophagy is inherent to the embryonic development of M. olfersii, and that it can be activated by exposure to UVB radiation. Data obtained contribute to the understanding of mitophagy in embryonic cells of aquatic invertebrates and to the current knowledge about the impact of UVB radiation on these organisms. In view of the obtained results, it is proposed the identification of mitophagy as a biomarker of exposure to UVB radiation.