Espécies reativas de nitrogênio e oxigênio: determinação de captura por polifenóis e efeitos sobre o DNA utilizando eletroforese capilar convencional, no formato microchip e como ferramenta microfluídica em um inovador modo de micro análise por injeção em fluxo

Abstract

O objetivo deste trabalho foi utilizar a eletroforese capilar e sua instrumentação para avaliar a captura, através de polifenóis, e o efeito sobre o DNA de espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio. Um método em eletroforese capilar convencional, utilizando injeção múltipla, para a determinação da capacidade antinitrosante de nove chás comerciais através da quantificação de nitrito foi desenvolvido. O software Peakmaster 5.3 foi utilizado para otimizar os parâmetros de separação. As curvas analíticas apresentaram boa linearidade (R2 > 0.999). Os limites de detecção (LD) para nitrito e nitrato foram de 0,32 e 0,06 mg L-1, respectivamente. Os limites de quantificação (LQ) para nitrito e nitrato foram 0,98 e 0,18 mg L-1, respectivamente. A precisão instrumental, a precisão intra-ensaio e a precisão intermediária determinadas para os dois analitos apresentaram valores de CV inferiores a 2,22% (para área do pico corrigida) e 0,71% (para tempo de migração corrigido). Constituintes fenólicos dos chás foram determinados por LC-ESI-MS/MS. Antes das injeções as amostras de chá foram incubadas por 1 hora a 37 °C na presença de nitrito de sódio em ácido perclórico em pH 2,3. Chá preto, chá verde e chá branco, contendo catequinas, apresentaram maior capacidade antinitrosante (96%; 93%; 89%, respectivamente). Eletroforese capilar em gel em microchip foi utilizada para analisar os efeitos de espécies nitrosantes e radical hidroxila (produzido via reação de Fenton e produzido por plasma frio) em marcadores de DNA e em DNA de baixo peso molecular de esperma de salmão. O kit DNA 1000 da Agilent foi utilizado para estimar o tamanho do DNA. A fim de avaliar o efeito dos radicais hidroxila via reação de Fenton, 2,4-dinitrofenol foi utilizado como substrato para otimizar parâmetros como pH e solvente. Os marcadores de DNA foram incubados, a pH 3,0, durante 30 e 60 min, com Fe(II) e peróxido de hidrogênio. Um segundo experimento foi realizado para avaliar efeitos da concentração dos reagentes de Fenton (Fe(II) e H2O2) nos marcadores de DNA após incubação durante 30 min a 37 °C. O DNA de baixo peso molecular foi exposto ao plasma frio de argônio durante 90 min. Os marcadores e o DNA de baixo peso molecular foram incubados a 37 °C com nitrito de sódio em ácido perclórico em pH 2,3. Os marcadores e o DNA de baixo peso molecular foram analisados no Bioanalyer 2100 da Agilent em conjunto com os reagentes do kit DNA 1000 e o chip. A diminuição dos picos dos marcadores e do DNA foi promovida pelos radicais hidroxila e as espécies nitrosantes, provavelmente por oxidação e desaminação, respectivamente, das bases de DNA. A reação de Fenton com concentrações maiores de Fe(II) e peróxido de hidrogênio promoveram a fragmentação dos marcadores. Um sistema microfluídico utilizando o instrumento de CE foi desenvolvido para determinar a atividade antioxidante pelo radical DPPH. A reação entre antioxidante e DPPH foi realizada dentro do capilar baseado no método de difusão transversal de perfis de fluxo laminar, após a otimização dos parâmetros através do programa TDLFP. As reações e análises foram realizadas em um capilar de sílica fundida de 65,0 cm (75 µm D.I.) com um comprimento efetivo de 56,5 cm a 25 °C. As análises foram monitoradas a 517 nm. Um modo de injeção sanduíche, Antioxidante-DPPH-Antioxidante, com injeção a 50 mbar/3 s e utilizando ácido gálico como padrão antioxidante, apresentou melhores resultados. O método desenvolvido foi comparado ao método tradicional através da analise de sete antioxidantes e foi considerado similar. Três antioxidantes apresentaram resultados diferentes e observações apontam para uma abordagem cinética.<br>

Abstract : The aim of this study was to use capillary electrophoresis, technique and instrumentation, to evaluate capture, by polyphenols, and effect on DNA of reactive oxygen species and reactive nitrogen species. A conventional capillary electrophoresis method, using multiple injection, to determine the antinitrosating capacity of nine commercial teas through nitrite quantification was developed. Peakmaster 5.3 software was used to optimize the separation parameters. The analytical curves showed a good linearity (R2 > 0.999). The limits of detection (LD) for nitrite and nitrate were 0.32 and 0.06 mg L-1, respectively. The limits of quantification (LQ) for nitrite and nitrate were 0.98 and 0.18 mg L-1, respectively. Instrumental, intra-assay and intermediate precision determined for the two analytes showed CV values lower than 2.22% (corrected peak area) and 0.71% (corrected migration time). Phenolic constituents of the teas were determined by LC-ESI-MS/MS. Before the injections the tea samples were incubated by 1 hour at 37 °C in the presence of sodium nitrite in perchloric acid medium at pH 2.3. Black tea, green tea and white tea, catechin-containing, showed greater antinitrosating capacity (96%; 93%; 89%, respectively). Microchip capillary gel electrophoresis was used to analyze effects of nitrosating species and hydroxyl radical (produced via Fenton reaction and produced by non-thermal plasma) on DNA markers and salmon sperm low molecular weight DNA. Agilent DNA 1000 kit was used to estimate low DNA size. In order to evaluate hydroxyl effects via Fenton reaction, 2,4-dinitrophenol was used as substrate to optimize pH and solvent parameters. DNA markers were incubated, at pH 3.0, by 30 min and 60 min, with Fe(II) and hydrogen peroxide. A second experiment was performed to evaluate Fenton reagents (Fe(II) and H2O2) concentration effects on DNA markers after 30 min incubation at 37 °C. Low DNA was exposed to non-thermal argon plasma by 90 min. Markers and low DNA were incubated at 37 °C with sodium nitrite in perchloric acid medium at pH 2.3. Markers and low DNA were analyzed on the Agilent 2100 Bioanalyzer in conjunction with the DNA 1000 reagents and LabChip. Markers and low DNA peaks decrease was promoted by hydroxyl radicals and nitrosating species, probably by DNA base oxidation and deamination, respectively. Fenton reaction with higher Fe(II) and hydrogen peroxide concentrations promoted markers fragmentation. A microfluidic system using CE instrument was developed to determine antioxidant activity by radical DPPH. The reaction between antioxidant and DPPH was performed inside the capillary based at Transverse diffusion of laminar flow profiles method, after parameters optimization through TDLFP program. Reactions and analysis were performed in a fused silica capillary of 65.0 cm (75 µm id) with an effective length of 56.5 cm and set at 25°C. Analyses were monitored at 517 nm. A sandwich mode injection, Antioxidant-DPPH-Antioxidant, with 50 mBar/3 s injection and using gallic acid as antioxidant standard, showed better results. The developed method was compared to a traditional method through seven antioxidant analyses and was considered similar. Three antioxidants showed different results and observations point to a kinetic approach.