Toxicidade do herbicida Roundup WG sobre a morfofuncionalidade das células germinativas e somáticas durante a espermatogênese de Danio rerio

Abstract

Os ecossistemas aquáticos são importantes ambientes para manutenção de uma grande diversidade de espécies, e ao mesmo tempo um dos principais ambientes receptores de contaminantes provenientes de diferentes fontes. Dentre estes contaminantes, destacam-se os herbicidas a base de glifosato, como o Roundup, que são os mais utilizados mundialmente. Esse herbicida é solúvel em água, e após sua aplicação nas lavouras infiltra no solo, podendo chegar nos ecossistemas aquáticos e afetar organismos não-alvo, como os peixes. O objetivo deste estudo foi caracterizar a toxicidade do herbicida Roundup WG sobre a morfologia das células somáticas e germinativas, bem como sobre a qualidade espermática durante o processo de espermatogênese do peixe Danio rerio. Para tal, foi realizada inicialmente a determinação da concentração letal para 50% da população de ensaio (CL50) e a curva de sobrevivência para auxiliar na definição das concentrações testadas, que foram estabelecidas a partir das normativas do CONAMA (0,065 mg/L, 0,65 mg/L e 6,5 mg/L), sendo realizados dois períodos de exposição, 7 e 15 dias. A morfologia das células somáticas e germinativas foi avaliada por microscopia de luz e eletrônica de transmissão, enquanto que a qualidade das células germinativas foi avaliada por citometria de fluxo e RT-qPCR. A CL50 obtida foi de 42,61 mg/L, e a curva de sobrevivência mostrou que após 24 h houve mortalidade nas concentrações acima de 10 mg/L. As análises microscópicas demonstraram, após 15 dias, alterações na estrutura dos testículos, em particular na integridade dos prolongamentos citoplasmáticos das células de Sertoli, que delimitam os cistos germinativos e perda das pontes citoplasmáticas entre as células germinativas. Foram observadas ainda alterações nos compartimentos subcelulares das células de Sertoli e células germinativas, como perda da eletrondensidade do citoplasma, mitocôndrias dilatadas e perda de cristas mitocondriais. Além disso, nas células de Sertoli foi observado a presença de vesículas autofágicas com resíduos de membranas e acúmulo de partículas eletrodensas, acompanhada do aumento no nível de transcritos, após 7 dias de exposição, dos genes atg5, atg16, map1-lc3II e lamp2, envolvidos na formação da vesícula autofágica. Adicionalmente, foram observadas alterações na qualidade das células germinativas, verificada pelo aumento na produção de ERO após 7 dias e pela fragmentação do DNA em 7 e 15 dias de exposição. O nível de transcrito do gene cyp17a1, envolvido na regulação esteroidogênica, foi aumentado após 7 dias de exposição. Os resultados obtidos demonstram a toxicidade do Roundup WG e fornecem novos conhecimentos para melhor compreender as alterações na morfofuncionalidade das células somáticas e germinativas nos testículos de D. rerio.

Abstract : Aquatic ecosystems are important environments for the maintenance of a wide variety of species, and at the same time, one of the main environments receiving contaminants from different sources. Among these contaminants, glyphosate-based herbicides, such as Roundup, are the most widely used in the world. This herbicide is soluble in water, and after its application in crops, infiltrates the soil, reaches aquatic ecosystems and affects non-target organisms, such as fish. The aim of this study was to characterize the toxicity of the Roundup WG herbicide on somatic and germinative cell morphology, as well as sperm quality during the spermatogenesis process of the Danio rerio fish. For this purpose, the determination of the lethal concentration for 50% of the test population (LC50) and the survival curve were performed to help in the definition of the concentrations tested, which were established according to CONAMA (0.065 mg/L, 0.65 mg/L and 6.5 mg/L), with two exposure periods, 7 and 15 days. The somatic and germ cell morphology was evaluated by light microscopy and transmission electron microscopy, while the germ cell quality was evaluated by flow cytometry and RT-qPCR. The LC50 obtained was 42.61 mg/L, and the survival curve showed that after 24 h there was mortality at concentrations above 10 mg/L. Microscopic analyzes demonstrated after 15 days, changes in testis structure, particularly in the integrity of the cytoplasmic extensions of the Sertoli cells, which delimit the germinal cysts; loss of the cytoplasmic bridges between germ cells; as well as, the presence of atypical cells inside the lumen of seminiferous tubules. Changes were also observed in the subcellular compartments of Sertoli cells and germ cells, such as loss of cytoplasmic electron density, dilated mitochondria and loss of mitochondrial crests. In addition, in the Sertoli cells the presence of autophagic vesicles with membrane residues and accumulation of electrondense particles was observed, accompanied by an increase after 7 days of exposure, in the level of transcripts of the genes atg5, atg16, map1-lc3II and lamp2, involved in the formation of the autophagic vesicle. Besides that, changes in germ cell quality were observed, as evidenced by the increase in ROS production after 7 days and DNA fragmentation in 7 and 15 days of exposure. The transcript level of the cyp17a1 gene, involved in steroidogenic regulation, was increased after 7 days of exposure. The results obtained demonstrate the toxicity of Roundup WG and provide new knowledge to better understand the changes in morphofunctionality of somatic and germinative cells in the testis of D. rerio.