Toxicidade do metilmercúrio durante o desenvolvimento do coração: uma abordagem celular e tecidual utilizando embriões de gallus domesticus como modelo experimental

Abstract

O metilmercúrio (MeHg), forma mais tóxica do mercúrio orgânico, está associado a danos morfológicos, metabólicos e comportamentais nos indivíduos expostos. A neurotoxicidade do MeHg é um fenômeno bem documentado. No entanto, o efeito do MeHg sobre o desenvolvimento do coração ainda é pouco explorado. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do MeHg sobre a organização subcelular, os eventos do ciclo celular e da indução à apoptose nos cardiomiócitos das paredes ventriculares do coração em desenvolvimento, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo experimental. Ovos fertilizados foram incubados em condição de 37,5º C (± 0,5) de temperatura e 65% de umidade. Após 33 horas de incubação, os embriões foram expostos in ovo a 0,1 µg MeHg/50 µL de solução salina a 0,9%, sendo analisados no 10º dia embrionário (E10). Embriões controle foram expostos exclusivamente a 50 µL de solução salina a 0,9% e analisado em E10 (Comitê de Ética da Universidade Federal de Santa Catarina, CEUA - protocolo número 5843231018). Previamente a retirada dos embriões dos ovos, foi avaliado o número de batimentos cardíacos por minuto (bpm). Após, o tecido cardíaco foi destinado às análises teciduais, celulares e subcelulares, bem como marcações celulares por imunohistoquímica, TUNEL (Terminal Transferase dutp Nick end Labeling) e citometria de fluxo. Nos embriões expostos ao MeHg houve redução significativa de 76 bpm, quando comparado aos 104 bpm nos embriões controles. Cerca de 60% dos embriões expostos ao MeHg apresentaram alterações na organização tecidual do coração. Além disso, o MeHg induziu em 100% dos embriões expostos, o aparecimento de alterações ultraestruturais na organização das trabéculas ventriculares, bem como alterações subcelulares nas mitocôndrias (dilatações nas cristas mitocôndrias), aumento no espaço perinuclear e aumento do número de vesículas (eletrontransparentes, eletrondensas e autofágicas). Foi observada redução significativa no número de células em proliferação em ambos os ventrículos, concomitante ao aumento significativo da proteína p53, envolvida na checagem do ciclo celular. Foi observada redução significativa no número de células em apoptose no ventrículo direito (VD) nos embriões expostos ao MeHg. Ainda, o MeHg induziu estresse celular reconhecido pelo aumento significativo do número de células NOS3-positivas e pela redução significativa no número de células NOS1-positivas. Os resultados demonstraram que a exposição a uma única dose de 0,1 µg de MeHg in ovo induziu danos teciduais, celulares e subcelulares nas paredes ventriculares, que de modo sinérgico acarretaram na redução dos batimentos cardíacos, o que sem dúvida compromete o funcionamento do coração e o aporte sanguíneo necessário ao desenvolvimento embrionário.

Abstract: Methylmercury (MeHg), the most toxic form of organic mercury, is associated with morphological, metabolic and behavioral damage in exposed individuals. MeHg neurotoxicity is a well-documented phenomenon. However, the effect of MeHg on heart development is still poorly understood. Thus, the aim of this study was to investigate the effects of MeHg on subcellular organization, cell cycle events and induction of apoptosis in ventricular wall cardiomyocytes of the developing heart, using Gallus domesticus embryos as an experimental model. Fertilized eggs were incubated at 37.5 ° C (± 0.5) temperature and 65% humidity. After 33 hours of incubation, the embryos were exposed in ovo to 0.1 µg MeHg / 50 µL 0.9% saline and analyzed on the 10th embryonic day (E10). Control embryos were exposed exclusively to 50 µL of 0.9% saline and analyzed in E10 (Ethics Committee of the Universidade Federal de Santa Catarina, CEUA - protocol number 5843231018). Prior to the removal of egg embryos, the number of heartbeats per minute (bpm) was evaluated. Afterwards, cardiac tissue was destined to the tissue analysis, cellular and subcellular analysis, as well as cellular markings by immunohistochemistry, TUNEL (Terminal Transferase dutp Nick end Labeling) and flow cytometry. In embryos exposed to MeHg there was a significant reduction of 76 bpm, when compared to 104 bpm in control embryos. About 60% of the embryos exposed to MeHg showed alterations in the heart tissue organization. In addition, MeHg induced in 100% of the exposed embryos, the appearance of ultrastructural changes in the organization of ventricular trabeculae, as well as subcellular changes in mitochondria (dilatations in the mitochondrial ridges), increase in the number of vesicles (electron-transparent, electron-dense and autophagic). Significant reduction in proliferating cell number was observed in both ventricles, concomitant with the significant increase in p53 protein involved in cell cycle checking. Significant reduction in right ventricular (RV) apoptotic cell number was observed in embryos exposed to MeHg. In addition, MeHg induced cellular stress recognized by the significant increase in NOS3-positive cell numbers and the significant reduction in NOS1-positive cell numbers. The results showed that exposure to a single dose of 0.1 µg MeHg in ovo induced tissue, cellular and subcellular damage to the ventricular walls, which synergistically led to a reduction in heart rate, which undoubtedly compromises the functioning of the heart and the blood supply necessary for embryonic development.