Avaliação do potencial citotóxico de cardenolídeos de origem natural e semissintética

Abstract

Cardenolídeos são usados tradicionalmente no tratamento de patologias cardíacas e têm sido investigados amplamente para novas finalidades terapêuticas, como a inibição de tumores. Um dos tipos de câncer atualmente em ensaios clínicos com cardenolídeos é o de pulmão, um dos tipos mais agressivos, com pouca sintomatologia nos estágios iniciais e baixa taxa de sobrevida. Neste trabalho, o potencial citotóxico do cardenolídeo natural digitoxigenina bisdigitoxosídeo (DGXB) e dos cardenolídeos semissintéticos 2-aminoacetamida-digitoxigenina (C18) e 2-azidoacetamida-digitoxigenina (C17) foi avaliada em sete diferentes linhagens celulares tumorais e não tumorais. A DGXB e o C18 se destacaram pela seletividade para células tumorais, e duas linhagens celulares não pequenas de pulmão A549 e H460 foram as mais sensíveis aos tratamentos, e o mecanismo de morte celular foi nelas investigado. Os valores de CC50 da DGXB foram de 23,7 nM e 25,5 nM em células A549 e H460, respectivamente, e do C18 foram de 104,1 nM e 119,8 nM em células A549 e H460, respectivamente. A viabilidade de ambas as linhagens celulares foi reduzida também no modelo de esferoides 3D. Houve aumento da externalização da fosfatidilserina e, com exceção do C18 em células H460, também houve aumento da atividade das caspases 3 e 7, eventos característicos de apoptose. O número de organelas vesiculares acídicas aumentou com os tratamentos, sugerindo o provável envolvimento da autofagia, mas sem comprovação de morte celular autofágica. Não foram observadas características de necrose. Além dos efeitos citotóxicos, foram observados efeitos citostáticos por até 18 dias. O ciclo das células foi bloqueado nas fases G1 e G2/M, e o potencial clonogênico e a duplicação cumulativa de células foram reduzidos, com indução de células X-gal positivas. Adicionalmente, o potencial invasivo das células H460 altamente metastáticas foi reduzido. De maneira geral, a DGXB foi o cardenolídeo mais citotóxico e apresentou ação sinérgica com os fármacos metformina, verapamil e metotrexato na inibição da proliferação das células A549 e H460. Em conjunto, os resultados obtidos demonstraram o potencial citotóxico desses dois cardenolídeos, e sugeriram combinações sinérgicas inéditas perante as duas linhagens celulares tumorais de pulmão testadas.

Abstract : Cardenolides are traditionally used to treat cardiac pathologies and have been widely investigated for new therapeutical purposes such as tumor inhibition. Lung cancer is one of the most agressive type of cancer, presenting few symptoms and low survival rate. Cardenolides are currently being evaluated in clinical trials to treat lung cancer. The present study investigated the natural cardenolide digitoxigenin bisdigitoxoside (DGXB) and the semissintetic cardenolides 2-aminoacetamide-digitoxigenin (C18) and 2-azidoacetamide-digitoxigenin (C17) against seven diferent tumoral and non-tumoral cell lines. The high selectivity for tumoral cells highlighted DGXB and C18, presenting toxicity notably to A549 and H460 small lung cancer cell lines, therefore selected to evaluate death mechnism. DGXB CC50 values were 23.7 nM and 25.5 nM, and C18 CC50 values were 104.1 nM and 119.8 nM in A549 and H460 cells, respectively. The viability of both cell lines was also reduced in the spheroid 3D model. Phosphatidylserine exposure and caspases 3 and 7 activity were increased with the exception of C18 in H460 cells, revealing apoptosis characteristic events. An acidic vesicular organelles accumulation was observed and quantified, suggesting autophagy involvement, but not autophagic cell death. Necrosis was not observed. Besides cytotoxic effects, cytostatic effects were observed for up to 18 days. Cell cycle was blocked at G1 and G2/M phases, clonogenic potential and cumulative population doubling were reduced and X-gal positive cells induction was observed. In addition, both cardenolides diminished the highly metastatic H460 cells invasive potential. In general, DGXB was the most cytotoxic cardenolide and presented synergistic effects with metformin, verapamil and methotrexate, inhibiting A549 and H460 cells proliferation. Together, the results obtained demonstrated the cytotoxic potential of DGXB and C18, and suggested new synergistic combinations against the two lung tumor cell lines tested.