Avaliação dos mecanimsos de morte celular induzidos por sulfonamidas sintéticas derivadas de 2,4-dinitrobenzenosulfonila em linhagens de células de leucemias agudas humanas

Abstract

As leucemias agudas (LAs) são doenças heterogêneas caracterizadas pela proliferação clonal de células hematopoiéticas na medula óssea e/ou nos tecidos linfoides. A principal estratégia de tratamento para as LAs é a quimioterapia, entretanto, esse tipo de terapia está associado a severas reações adversas e a altas taxas de recidiva, o que torna necessária a busca por novos compostos antileucêmicos. Nesse contexto, sulfonamidas são compostos com diversas atividades biológicas descritas na literatura, dentre as quais, a atividade antitumoral. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de uma série de sulfonamidas sintéticas sobre as células de linhagens de LAs humanas K562 (LMA) e Jurkat (LLA) e selecionar os compostos mais citotóxicos para a investigação dos seus principais mecanismos de morte celular. Após realizar a triagem de 17 sulfonamidas nas células K562, as três mais citotóxicas foram selecionadas para os ensaios posteriores, 1E68Y, 1E68R e 1E68DI. As três sulfonamidas causaram citotoxicidade dependente do tempo e da concentração, além de alterações morfológicas características de apoptose em ambas as linhagens celulares avaliadas. Além disso, nenhuma delas causou hemólise em eritrócitos saudáveis. A sulfonamida mais citotóxica para ambas as linhagens, 1E68DI, foi selecionada para a continuidade dos experimentos. O composto selecionado não foi citotóxico para células mononucleadas e apresentou alta seletividade para as linhagens de LA. A sulfonamida 1E68DI exerce seu efeito citotóxico por mecanismos distintos nas linhagens de leucemia avaliadas, pois causou bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, nas células K562, e na fase G0/G1, nas células Jurkat. Além disso, ao avaliar fatores envolvidos na ativação da apoptose, verificou-se que o composto causa a exposição de fosfatidilserina, associada aos eventos iniciais desse tipo de morte celular, somente nas células Jurkat. Ainda, com relação às células K562, os resultados demonstraram que a citotoxicidade da sulfonamida 1E68DI está associada à ativação tanto da apoptose extrínseca, devido ao aumento da expressão de FasR, como da apoptose intrínseca, pois houve redução do número de células com potencial mitocondrial intacto e aumento da expressão da proteína pró-apoptótica AIF nessa linhagem celular. Quanto às células Jurkat, alguns resultados demonstram apenas o envolvimento da apoptose intrínseca como um mecanismo de citotoxicidade do composto selecionado, pois além de reduzir o número de células dessa linhagem com potencial mitocondrial intacto, o mesmo causou uma redução na expressão da proteína antiapoptótica survivina. A expressão das proteínas antiapoptótica Bcl-2 e pró-apoptótica Bax não sofreu alterações significativas em ambas as linhagens de LA avaliadas, enquanto que o aumento da expressão de caspase-3 ativada foi observado apenas na linhagem K562 após o tratamento com o composto. Os resultados obtidos com 1E68DI fornecem novas informações a respeito do mecanismo de citotoxicidade de sulfonamidas sobre células de linhagens leucêmicas e sugerem que esse composto pode ser um candidato promissor ao desenvolvimento de fármacos para o tratamento de LAs.

Abstract : Acute leukemias (ALs) are heterogeneous diseases characterized by the clonal proliferation of hematopoietic cells in the bone marrow and/or in lymphoid tissues. The main treatment strategy for ALs is chemotherapy; however, this kind of therapy is associated with severe adverse reactions and with high relapse rates, which makes the search for new antileukemic compounds a necessity. In this context, sulfonamides are compounds that have several biological activities described in the literature and, among them, the antitumor activity. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of a series of 17 synthetic sulfonamides in K562 (AML) and Jurkat (ALL) human AL cell lines and then select the most cytotoxic compounds for the investigation of their main cell death mechanisms. After screening in K562 cells, the three most cytotoxic compounds were selected for the subsequent assays: 1E68Y, 1E68R and 1E68DI. All three selected sulfonamides induced time and concentration-dependent cytotoxicity, as well as morphological changes suggestive of apoptosis in both K562 and Jurkat cell lines. In addition, none of them caused hemolysis in healthy erythrocytes. The most cytotoxic sulfonamide in both cell lines, 1E68DI, was selected for the following experiments. 1E68DI was not cytotoxic to mononuclear cells and showed a high selectivity for AL cell lines. Sulfonamide 1E68DI exerts its cytotoxic effect in leukemia cells by distinct mechanisms, as it caused cell cycle blockade at G2/M phase in K562 cells, and at G0/G1 phase in Jurkat cells. In addition, when evaluating the main factors involved in the activation of apoptosis, the compound caused phosphatidylserine exposure, which is associated with the early events of this type of cell death, only in Jurkat cells. Furthermore, regarding K562 cells, the results demonstrated that the cytotoxicity of sulfonamide 1E68DI is associated with the activation of both extrinsic apoptosis, due to an increased FasR expression, and intrinsic apoptosis, as we observed the loss of mitochondrial potential and an increased expression of the pro-apoptotic protein AIF. As for Jurkat cells, the results showed the involvement of intrinsic apoptosis only, with mitochondrial potential loss and a reduced expression of antiapoptotic protein surivivn. The expression of the antiapoptotic and pro-apoptotic proteins Bcl-2 and Bax did not change neither in K562 nor in Jurkat cells after treatment with 1E68DI, whereas the increased expression of activated caspase-3 was observed only in K562 cells. The results obtained with 1E68DI provide new information about the cytotoxic mechanisms of sulfonamides in leukemia cell lines and suggest that this compound may be a promising candidate for the development of new drugs for the treatment of ALs.