Proteínas expressas diferencialmente em hemócitos do camarão branco, Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931), infectado com o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV

Abstract

O vírus da síndrome da mancha branca (white spot syndrome virus, WSSV) é considerado como o vírus mais devastador para camarões cultivados, estando associado com grandes perdas econômicas registradas na carcinicultura mundial. A proteômica permite a determinação do perfil diferencial de proteínas expressas em diferentes condições metabólicas, bem como frente à exposição a agentes estressores, agentes patogênicos e contaminantes. Neste estudo a análise proteômica foi aplicada na investigação das respostas moleculares do camarão branco do Pacífico, Litopenaeus vannamei, frente à infecção pelo WSSV, buscando fornecer subsídios para o delineamento de estratégias eficazes para minimizar o impacto do vírus nos cultivos. Camarões, L. vannamei, livres de patógenos específicos (Shrimp Pathogen Free, SPF) (n=180), com aproximadamente 13,0±0,5 g, foram aclimatados em aquários individuais (n=1/aquário), e, após a coleta de hemolinfa, e nova aclimatação, foram infectados, experimentalmente, com um inóculo, contendo 1,3 x 104 cópias virais do WSSV. Os camarões sobreviventes, 56 dias após a infecção experimental (6%), foram classificados como camarões mais tolerantes (grupo Tolerantes = T), enquanto que os primeiros camarões a apresentar os sinais da doença, e morrer, foram classificados como mais susceptíveis ao WSSV (grupo Susceptíveis = S). Os hemócitos dos camarões T e S, obtidos a partir das amostras de hemolinfa coletadas antes da infecção experimental, foram submetidos à análise proteômica, objetivando a determinação do perfil diferencial de proteínas expressas nessas células nos dois grupos (T versus S no tempo zero, T0, antes da infecção: T0T x T0S) Capítulo 1. Paralelamente, os hemócitos dos camarões mais tolerantes, obtidos das amostras de hemolinfa coletadas antes e após a infecção experimental, foram submetidos à análise proteômica, objetivando a determinação do perfil diferencial de proteínas expressas nessas células nos camarões mais tolerantes (T no tempo zero, T0, antes da infecção versus T no tempo final do desafio experimental, TF, após a infecção: T0T x TFT) Capítulo 2. Um total de 73 spots protéicos diferencialmente expressos (p<0,05) foram selecionados para identificação por espectrometria de massa (MALDI-TOF/PMF). Destes, 65 mostraram correspondência com proteínas que, uma vez identificadas e classificadas de acordo com as anotações no Gene Ontology, foram relacionadas a processos biológicos e funções moleculares envolvendo respostas do sitema imune inato, metabolismo energético e/ou regulação enzimática, metabolismo de carboidratos, estrutura e integridade celular, transporte citoplasmático/ endossomal, mediadores de transdução de sinal, transcrição, enovelamento correto de proteínas, regulação da expressão gênica, excreção de moléculas tóxicas e transporte de moléculas pouco solúveis, mediação da entrada de íons de cálcio, sinalização intracelular, diferenciação e proliferação celular, apoptose, entre outros. O possível significado do envolvimento de algumas dessas proteínas na resposta do hospedeiro ao WSSV foi discutido e um total de treze alvos protéicos distintos foram propostos como potenciais biomarcadores moleculares de tolerância/susceptibilidade ao vírus. Esses potenciais biomarcadores moleculares são apontados neste estudo como indicadores, e/ou como possíveis ferramentas, para o monitoramento dos cultivos e/ou, ainda, para a seleção de camarões reprodutores com maior grau de tolerância ao WSSV.

Abstract: The white spot syndrome virus (WSSV) is considered as the most devastating virus for farmed shrimp and has been associated to huge economical losses worldwide. Proteomics allows the determination of the differential profile of expressed proteins under different metabolic conditions, as well as upon the exposure to stress, pathogenic agents and contaminants. Herein, proteomic analysis was used as a tool to investigate the molecular responses of the Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei, towards the infection by WSSV, in order to furnish data to outline strategies to minimize the impact of the virus in farmed shrimp. Shrimp, L. vannamei, specific pathogen free (SPF) (n=180), of 13.0 ± 0.5 g, were individually acclimated (n=1/aquarium) and, after having hemolymph collected and being submitted to a new acclimation, were experimentally infected with a WSSV inoculum (1.3 x 104 viral copies). After 56 days post-infection, shrimp that survived (6%) were classified as more tolerant (Tolerant Group = T), whereas those who first displayed external signs of the infection and died were classified as susceptible to WSSV (Susceptible Group = S).The hemocytes of shrimp from group T and group S, obtained from hemolymph collected before the experimental infection, were submitted to proteomic analysis aiming to determine the differential profile of the expressed proteins in these cells in both groups ((T versus S at time zero, T0, before infection: T0T x T0S) Chapter 1. Likewise, hemocytes from group S, obtained from hemolymph collected before and after the experimental infection, were used for proteomic analysis, in order to determine the differential profile of expressed proteins in these cells of S shrimp (T at time zero, T0, before the infection versus T at the end of the viral challenge, TF, after the infection, T0T x TFT) Chapter 2. A total of 73 differentially expressed protein spots (p<0.05) were selected for identification by mass spectrometry (MALDI-TOF / PMF). Among those, 65 proteins were identified and classified according to the annotations of Gene Ontology and showed to be related to several biological processes and molecular functions, such as responses of the innate immune system, energy metabolism and/ or enzymatic regulation, carbohydrate metabolism, cellular structure and integrity, cytoplasmic/ endossomal transport, mediators of signaling transduction pathway, transcription, correct protein folding, gene expression regulation, excretion of toxic molecules and transport of poorly soluble molecules, calcium ion transport mediation, intracellular signaling, cell differentiation and proliferation, apoptosis, among others. The possible relevance of the role of some of these proteins in the host response to WSSV was discussed and a total of 13 distinct protein targets were proposed as potential molecular biomarkers of tolerance/ susceptibility to the virus. These potential molecular biomarkers could be used as indicators and/ or as tools for monitoring farmed shrimp and/ or for selecting shrimp with higher tolerance to WSSV.