Técnicas de eletroporação: dispositivo eletrônico e ensaios em leveduras

Abstract

A eletroporação (EP) é o fenômeno do aumento da permeabilidade da membrana celular quando a célula é exposta a campos elétricos de amplitude acima de dezenas de kV/m e durações de nano segundos a segundos. O aumento da permeabilidade é explicado pela formação de poros na membrana celular. Dependendo da configuração do protocolo aplicado, a membrana plasmática pode se fechar, caracterizando EP reversível, ou pode não se recuperar (processo irreversível e morte celular). As aplicações da EP são: tratamento de câncer, transferência genética, extração de material intracelular e pasteurização. Esse trabalho teve como objetivo desenvolvimento de equipamento para tratamentos por campos elétricos pulsados, estudos de viabilidade celular, alteração de propriedades elétricas e de membrana de células. Foram utilizadas leveduras Saccharomyces Cerevisiae como modelo de células tumorais e campos elétricos de 200 a 800 kV/m. O equipamento desenvolvido é um gerador de sinais programável e compatível aos protocolos de EP para tratamento de câncer (ESOPE), transferência genética e extração de conteúdo intracelular. O protótipo suporta diferentes configurações de eletrodos, possui saída variável em tensão (até 800 V e corrente máxima de saída de 12 A) e possui módulo de aquisição de sinais (frequência de aquisição de 200 kHz) de tensão (resolução de < 7 V) e corrente (resolução < 50 mA até 5 A ou resolução < 240 mA até 12 A). O estudo com leveduras concluiu perda de viabilidade e perda da integridade da estrutura celular em protocolos superiores a 300 kV/m. Foram detectados indícios de correlação entre alterações de condutividade e perda de viabilidade celular por eletroporação irreversível. Os estudos com microscopia eletrônica forneceram detalhes que não são percebidos em análises de propriedades elétricas macroscópicas.

Abstract : Electroporation (EP) is the phenomenon of increased cell membrane permeability when the cell is exposed to electric fields of amplitude above tens of kV/m and durations of nanoseconds to seconds. The increase in permeability is explained by the formation of pores at the plasma membrane. Depending on the protocol configuration, the plasma membrane may close, characterizing a reversible electroporation, or it may not recover, causing an irreversible electroporation and cell death. The applications of EP are: cancer treatment, genetic transfer, extraction of intracellular material and pasteurization. The objective of this work was the development of equipment for pulsed electric fields treatments, study of cell viability, changes in electrical and cell membrane properties. Saccharomyces Cerevisiae yeast was used as a model of tumor cells and electric fields from 200 to 800 kV/m were applied. The developed equipment is a programmable signal generator compatible with EP protocols for treatment of cancer (ESOPE), gene transfer and intracellular content extraction. The prototype supports different electrode configurations, has variable voltage output (up to 800 V and maximum output current of 12 A) and has a voltage acquisition module (200 kHz acquisition frequency) (< 7 V resolution) and current (resolution < 50 mA up to 5 A or resolution of < 240 mA up to 12 A). Based on the yeast study loss of viability and loss of cellular structure occurs when protocols are over 300 kV/m. Changes in electrical conductivity and loss of cell viability by irreversible electroporation may be correlated. Electron microscopy study provided details that are not observed in the macroscopic analysis of electrical properties.