Epidemiologia molecular e avaliação de testes laboratoriais para diagnóstico da tuberculose em amostras clínicas do hospital universitário Polydoro Ernani de São Thiago - HU/UFSC e desenvolvimento e otimização de um teste de PCR quantitativo para detecção de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis. A cultura é o método padrão-ouro no diagnóstico laboratorial de TB, mas o resultado é obtido em até oito semanas em meio de cultura sólido e em até seis semanas em meio de cultura líquido. A baciloscopia apresenta resultado rápido, porém sua sensibilidade é baixa, especialmente na TB extrapulmonar. Uma boa alternativa é a utilização de testes moleculares, como por exemplo, o teste Xpert® MTB/RIF. Além disso, é importante o desenvolvimento de metodologias in house, que tornam o custo mais acessível. Este trabalho foi dividido em três capítulos experimentais (CE), sendo o CE-I um estudo descritivo retrospectivo para avaliação do teste Xpert® MTB/RIF em amostras de rotina do Hospital Universitário da UFSC, o CE-II um estudo descritivo prospectivo analisando os dados clínicos e epidemiológicos dos participantes, bem como a avaliação do teste Xpert® MTB/RIF em reação à cultura sólida e líquida e aplicação de metodologias de epidemiologia molecular diretamente de restos de reação do teste Xpert® MTB/RIF e o CE-III o desenvolvimento e a otimização de uma qPCR para diagnóstico da TB utilizando sondas de hidrólise. Na cultura líquida e na cultura sólida houve o crescimento de 17/19 e 18/19 amostras pulmonares e 3/4 e 4/4 amostras extrapulmonares de pacientes com TB. A tosse por mais de duas semanas, a perda de peso, a sudorese noturna e o contato prévio com pessoas com TB foram significativamente mais presentes em participantes com TB pulmonar (cultura positiva) do que em participantes sem TB pulmonar (cultura negativa). A sensibilidade da baciloscopia nas amostras pulmonares variou entre 70 e 80%, exceto para os participantes com TB prévia, onde foi obtido 100% se sensibilidade. Em amostras extrapulmonares a sensibilidade da baciloscopia foi baixa. Já o teste Xpert® MTB/RIF teve sensibilidade e especificidade acima de 95% em amostras pulmonares. Apesar da alta especificidade, a sensibilidade em amostras extrapulmonares do teste Xpert® MTB/RIF ficou próxima a 40%. Foi possível obter os perfis do MIRU-15 a partir do DNA genômico presente nos restos de reação em amostras que amplificaram no Xpert® MTB/RIF com Cq menor ou igual a 24, mas os perfis do spoligotyping foram obtidos com sucesso somente a partir do isolado clínico. A qPCR in house desenvolvido apresentou ótima performance analítica, especialmente nos limites de detecção, que foram de 4,7 cópias, 11,8 cópias e 23,6 cópias por reação, respectivamente para os alvos IS6110, IS1081 e senX3.

Abstract : Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis complex bacteria. Culture is the gold standard method for laboratory diagnosis of TB, but it can take up to 8 weeks in solid medium and up to 6 weeks in liquid medium. Smear microscopy is a fast method, but its sensitivity is low, especially in extrapulmonary TB. A good alternative is the use of molecular tests, such as Xpert® MTB/RIF test. In addition, it is important to develop in-house methodologies that make the cost more affordable. This study was divided in three experimental chapters (CE): CE-I is a retrospective descriptive study for evaluation of the Xpert® MTB/RIF test in routine samples of the University Hospital of UFSC, CE-II is a prospective descriptive study that analyzes the clinical and epidemiological data of the participants, as well as the evaluation of the Xpert® MTB/RIF test in response to solid and liquid culture and application of molecular epidemiology methodologies directly to the reaction residues of Xpert® MTB/RIF test, and CE-III which shows the development and optimization of qPCR for diagnosis of TB using hydrolysis probes. In liquid and solid culture there was growth of 17/19 and 18/19 pulmonary samples and 3/4 and 4/4 extrapulmonary samples of patients with TB. Coughing for more than two weeks, weight loss, night sweats and previous contact with people with TB were significantly more prevalent in participants with pulmonary TB (positive culture) than in participants without pulmonary TB (negative culture). The sensitivity of the smear microscopy in pulmonary samples varied between 70 and 80%, except for the participants with previous TB, where 100% of sensitivity was obtained. The sensitivity of the smear microscopy was low in extrapulmonary samples. However, Xpert® MTB/RIF test had sensitivity and specificity above 95% in pulmonary samples. Despite the high specificity, sensitivity in extrapulmonary samples was close to 40% for Xpert® MTB/RIF test. It was possible to obtain MIRU-15 profiles from the genomic DNA present in the reaction residues in samples that amplified on Xpert® MTB/RIF with Cq less than or equal to 24, but the spoligotyping profiles were only successfully obtained from clinical isolate. The developed in-house qPCR presented excellent analytical performance, especially at detection limits, which were 4.7 copies, 11.8 copies and 23.6 copies per reaction, respectively for IS6110, IS1081 and senX3 targets.