Mecanismos envolvidos na nocicepção induzida pelo veneno da Bothrops jararaca em camundongos: evidências da participação dos receptores de potencial transitório tipo anquirina 1

Abstract

Os acidentes ofídicos causados por serpentes compreendem uma doença tropical negligenciada, acomentendo pelo menos 1,8 a 2,7 milhões de pessoas em todo o mundo anualmente, especialmente em populações empobrecidas que vivem em países em desenvolviemento. Os sintomas locais estão presentes na maioria desses acidentes, dentre os quais destacam-se a dor e o edema. Os venenos de serpentes contêm vários componentes com a capacidade de evocar, exacerbar e sustentar a sensação de dor e o edema, incluindo ativadores do inflamassoma, dos receptores tipo-toll (TLRs) e dos receptores de potencial transitório (TRPs). Entretanto, os mecanismos moleculares envolvidos na dor e no edema causados pelo veneno da Bothrops jararaca (BjV), a principal responsável pelos acidentes ofídicos no Brasil, são poucos conhecidos. No presente estudo, o objetivo foi investigar o envolvimento dos TRPs na nocicepção e edema induzidos pelo BjV. Primeiramente, foram caracterizadas a nocicepção e o edema induzidos pela injeção subcutânea do BjV em camundongos. Verificou-se que o BjV induziu uma significativa nocicepção aguda, apresentando pico de resposta entre 5-10 min após a injeção. O BjV também induziu hiperalgesia mecânica, comportamento afetivo-motivacional (AMB), alodínia ao frio e edema, observados a partir de 1 h, com pico em 3 h e duração de até 6 h após a administração. A ação nociceptiva e edematogênica do BjV foi similar em camundongos machos e fêmeas. Em seguida, foram utilizadas estratégias farmacológicas e genéticas (deleção gênica) para investigar o envolvimento dos TRPs na nocicepção e edema induzidos pelo BjV. A desfuncionalização das fibras sensoriais TRPV1 positivas (TRPV1 +), realizada pelo pré-tratamento com resiniferatoxina duas vezes ao dia, preveniu o desenvolvimento de todos os parâmetros nociceptivos avaliados, sem alterar o edema. Por outro lado, o uso de um antagonista (SB366791) ou a deleção gênica do TRPV1 não alteraram a nocicepção ou o edema induzidos pelo BjV. Notavelmente, a nocicepção aguda induzida pelo BjV, a hiperalgesia mecânica, o AMB e a alodinia a frio foram prevenidas pelo antagonismo do TRPA1 ou pela sua deleção gênica. Também, ensaios in vitro foram usados para verificar o efeito do BjV no influxo de cálcio em cultura primária de neurônios dos gânglios da raiz dorsal (GRD) ou células HEK293 expressando canais TRPV1 ou TRPA1. Nesse sentido, o BjV induziu o influxo de cálcio em células HEK293 transfectadas com o TRPA1, mas não com canais TRPV1. Além disso, o BjV promoveu influxo de cálcio em neurônios GRD de ratos, sendo significativamente prevenido por um antagonista TRPA1 (alil isotiocianato), mas não prevenido por um antagonista TRPV1 (capsazepina). Da mesma forma, o BjV induziu influxo de cálcio em neurônios GRD de camundongos tipo-selvagem, mas não de camundongos com deleção gênica para os canais TRPA1. Além disso, a nocicepção e o edema induzidos pelo BjV foram prevenidos por um inibidor de metaloprotease (1,10-Fenantrolina) ou por um inibidor da fosfolipase A2 (PLA2) (brometo de p-bromofenacila, com exceção da nocicepção aguda) e também pela fervura do BjV. A injeção subcutânea da fração P1 ou da fração P2, obtidas do BjV por separação cromatográfica, induziram hiperalgesia mecânica, AMB, alodínia ao frio e edema. Por outro lado, a nocicepção aguda foi induzida apenas pela fração P2. As outras frações obtidas do BjV (P3, P4 e P5) não foram capazes de promover o desenvolvimento de nocicepção e edema. Foi demonstrado que a atividade da metaloproteases do BjV está concentrada na fração P1, enquanto que a atividade enzimática de PLA2 está concentrada na fração P2. Assim, nossos resultados sugerem que a nocicepção induzida pelo BjV, mas não o edema, é mediada por uma ativação direta do canal TRPA1 em fibras TRPV1 +, e que esse efeito pode ser mediado pelas metaloproteases ou pelas PLA2, ou ainda, por ambas as enzimas presentes no veneno.

Abstract : Snakebite envenoming is a neglected tropical disease occurring in at least 1.8 2.7 million people worldwide per year, especially in impoverished populations living in the rural tropics. Local symptoms are present in most snakebite envenoming, of which pain and edema stands out. Snake venoms contain various factors with the ability to evoke, enhance and sustain pain sensation and edema, including activators of the inflamasome, toll-like receptors (TLRs) and transient receptor potential channels (TRPs). However, the molecular mechanisms involved in pain and edema caused by the venom of Bothrops jararaca (BjV), the main cause of snakebites in Brazil, are almost unknown. Here, we aimed to investigate the involvement of TRPs on Bothrops jararaca venom (BjV)-induced nociception and edema. Firstly, nociception and edema induced by subcutaneous injection of BjV in mice were characterized. It was found that BjV significantly caused acute nociception (licking time), presenting peak response between 5-10 min after injection. Also BjV induced mechanical hyperalgesia, affective-motivational behavior (AMB), cold allodynia and edema starting at 1 h, peaking at 3 h and lasting up to 6 h after administration. Of note, nociceptive and edematogenic action of BjV were similar in both male and female mice. After that, pharmacological and genetic approuchs (gene deletion) were used to investigate the involvement of TRPs on BjV-induced nociception and edema. The defunctionalization of TRPV1-positive (TRPV1+) sensory fibers produced by resiniferatoxin pre-treatment twice daily prevented the development of all nociceptive parameters evaluated, without altering edema. On the other hand, the antagonism (SB366791) or gene deletion of TRPV1 did not alter BjV-induced nociception or edema. Notably, BjV-induced acute nociception, mechanical hyperalgesia, AMB and cold allodynia were largely prevented by TRPA1 antagonism or gene deletion. Also, in vitro assays were used to verify the action of BjV on calcium transients of cultured dorsal root ganglia (DRG) neurons or HEK293 cells expressing TRPV1 or TRPA1 channels. In these sense, BjV induced calcium influx in HEK293 cells transfected with TRPA1, but not with TRPV1 channels. Moreover, BjV caused calcium influx in rat DRG neurons, wich was significantly prevented by a TRPA1 antagonist (allyl isothiocyanate), but not prevented by a TRPV1 antagonist (capsazepine). Similarly, BjV induced calcium influx in DRG neurons of wild-type mice, but not of TRPA1 knockout mice. Moreover, BjV induced nociception and edema were prevented by a metaloprotease inhibitor (1,10-Phenantroline) or by a fosfolipase A2 (PLA2) inhibitor (p-bromophenacyl bromide, with exception of acute nociception) and also by BjV boling. In addition, subcutaneous injection of Fraction P1 or Fraction P2, obtained from BjV by chromatographic separation, induced mechanical hyperalgesia, AMB, cold allodynia and edema. On the other hand, acute nociception was only induced by the P2 fraction. The other fractions obtained from BjV (P3, P4 and P5) were not able to promote development of nociception and edema. Interestingly, it was demonstrated that BjV metaloprotease activity is concentrated in Fraction P1, whereas, PLA2 enzymatic activity is concentrated in Fraction P2. Our present results suggest that BjV-induced nociception, but not edema, is mediated by a direct TRPA1 channel activation in TRPV1+fibers, and that this effect could be mediated by metalloproteases or PLA2 or by both enzymes present in the venom.