Efeito parácrino de células da papila dérmica no reparo cutâneo: ativação de fibroblastos, produção de matriz extracelular e proteção ao fotoenvelhecimento

Abstract

As células da papila dérmica (CPD) são consideradas como chave central do processo de sinalização que controla o complexo sistema de morfogênese e crescimento do folículo piloso. Contudo, a contribuição destas células, por meio de moléculas secretadas (efeito parácrino), no reparo cutâneo e proteção ao fotoenvelhecimento da pele adjacente não está completamente elucidada na literatura. Os fibroblastos dérmicos são elementos fundamentais para o restabelecimento da homeostase e reparo da pele, tendo atividade destacada na promoção do fechamento da lesão e na produção e remodelamento da matriz extracelular (MEC), funções também relacionadas com a fisiopatologia do fotoenvelhecimento. O presente trabalho investigou, em modelos murino e humano, os efeitos parácrinos das CPD no reparo cutâneo in vitro, avaliando a ativação de fibroblastos, produção de MEC e envolvimento de vesículas extracelulares (VE), além de proteção ao fotoenvelhecimento. Para isso, primeiramente, CPD foram isoladas pela técnica de explante a partir de papilas dérmicas dissecadas de folículos pilosos de camundongos e humanos. Após expansão, foi coletado o meio condicionado das células da papila dérmica murinas (MC-CPDm) e este foi avaliado em modelo de cultivo organotípico do folículo piloso, demonstrando que o MC-CPDm estimula o crescimento do pelo, mantendo a habilidade indutora sobre o folículo piloso. Em seguida, o MC-CPDm foi estudado frente a ativação de fibroblastos murinos (3T3), avaliando a proliferação, a migração e a conversão fibroblasto-miofibroblasto, através do ensaio de contração de colágeno e avaliação da expressão de a-SMA. Os resultados obtidos demonstraram que o MC-CPDm estimula a proliferação e o fechamento da lesão in vitro, reduzindo a conversão fibroblasto-miofibroblasto. Visando a potencial aplicação biotecnológica e clínica para potencialização do processo de reparo cutâneo com maior qualidade de cicatrizes por meio da ativação do remodelamento dérmico, a ativação de fibroblastos e a produção de MEC foi avaliada em células humanas. Para isso, foi coletado o meio condicionado das células da papila dérmica humanas (MC-CPDh) e este foi avaliado quanto a proliferação e migração de fibroblastos dérmicos humanos, demonstrando que o MC-CPDh estimula a proliferação e migração celular. Em relação à produção de MEC, foi investigada a expressão proteica de colágeno I e fibronectina. Os resultados obtidos demonstraram que o MC-CPDh promoveu aumento na produção de fibronectina, entretanto não foi observada diferença significativa sobre a síntese de colágeno I. Uma vez que VE vêm sendo apontadas como importantes mediadores de efeitos parácrinos em diversos sistemas, a participação destas na interação com fibroblastos também foi investigada. As VE presentes no MC-CPDh (VE-CPDh) foram isoladas por ultracentrifugação e a interação vesícula-célula foi analisada através da observação da incorporação de VE-CPDh coradas com corante fluorescente por fibroblastos dérmicos, além da investigação da atividade biológica medida em termos de proliferação celular. Os resultados mostraram que VE-CPDh estão presentes no MC-CPDh e são incorporadas por fibroblastos dérmicos humanos. Além disso, demonstram que ambos, VE-CPDh e fatores solúveis presentes no sobrenadante da ultracentrifugação do MC-CPDh, atuam na proliferação de fibroblastos dérmicos humanos. Para avaliação da proteção ao fotoenvelhecimento, foi estabelecido modelo in vitro para o fotoenvelhecimento de fibroblastos dérmicos por exposição à radiação UVB. Os fibroblastos expostos à radiação UVB apresentaram os indicadores de fotoenvelhecimento, aumento na atividade de ß-galactosidase e expressão de p21, associado à morfologia característica de células senescentes e redução na produção de MEC (colágeno I e fibronectina). Em seguida, o efeito do MC-CPDh foi avaliado sobre a viabilidade celular e morte por apoptose em fibroblastos fotoenvelhecidos. Os resultados indicaram que o MC-CPDh estimulou a sobrevida destas células, exercendo efeito protetor contra a morte celular por apoptose, induzida pela exposição à radiação UVB. Quanto à produção de MEC, o MC-CPDh foi capaz de recuperar parcialmente expressão de fibronectina diminuída após fotoenvelhecimento dos fibroblastos dérmicos, porém não foi observado efeito sobre a produção de colágeno I. Em conjunto, os resultados sugerem que as CPD exercem efeito parácrino sobre fibroblastos dérmicos durante o processo de reparo cutâneo, promovendo os eventos celulares que levam ao fechamento efetivo da lesão, além de fornecer proteção contra o fotoenvelhecimento, favorecendo a sobrevida de fibroblastos fotoenvelhecidos. Em adição, VE-CPDh estão envolvidas nos efeitos observados e apontam para a relevância de sua exploração como uma promissora ferramenta terapêutica para o reparo cutâneo.

Abstract : Dermal papilla cells (DPC) are known as key signaling center that controls the complex system of morphogenesis and hair growth. However, the paracrine contribution of these cells to skin repair and photoaging protection remains elusive. Dermal fibroblasts are essential elements to skin homeostasis and repair, with highlighted activity in wound closure and extracellular matrix (ECM) production and remodeling. These functions are also related to the physiopathology of photoaging. The present work aimed to investigate in vitro the paracrine effects of DPC in skin repair, evaluating fibroblast activation, ECM production and the involvement of extracellular vesicles (EV), as well as photoaging protection. Firstly, DPC were isolated by dermal papilla explant from mice and humans hair follicles. After expansion, the murine dermal papilla cells conditioned medium (mDPC-CM) was collected and evaluated in hair follicle organotypic culture, demonstrating that it stimulates hair growth, maintaining the hair inductive ability. Then, the effect of mDPC-CM was evaluated concerning murine fibroblasts (3T3) activation - proliferation, migration and fibroblast-myofibroblast conversion, through the collagen contraction assay and a-SMA expression. Results showed that mDPC-CM stimulates the proliferation and wound closure in vitro and reduces fibroblast-myofibroblast conversion. Aiming for a biotechnological and clinical application to promote the skin repair with higher quality scars through the activation of dermal remodeling, fibroblast activation and ECM production were evaluated in human cells. For this, the human dermal papilla cells conditioned medium (hDPC-CM) was collected and the proliferation and migration of human dermal fibroblasts was evaluated. Data showed that hDPC-CM stimulates cell proliferation and migration. Regarding the ECM production, the protein expression of collagen I and fibronectin was investigated. The results showed that hDPC-CM promoted an increase in fibronectin production, with no difference in type I collagen. Since EV have been identified as important mediators in several systems, its participation in fibroblasts activation was also investigated. EV present in hDPC-CM (hDPC-EV) were isolated by ultracentrifugation and vesicle-cell interaction analyzed by incorporation of fluorescent stained-hDPC-EV by dermal fibroblasts. In addition, its biological activity was measured by cell proliferation. Results showed that hDPC-EV are present in hDPC-CM and are incorporated by human dermal fibroblasts. In addition, both hDPC-EV and soluble factors present in the hDPC-CM supernatant, stimulate the proliferation of human dermal fibroblasts. To evaluate photoaging protection, an in vitro photoaging model was established by exposure of dermal fibroblasts to UVB radiation. UVB-exposed-fibroblasts showed the photoaging indicators - increased ß-galactosidase activity and p21 expression, associated with senescent morphology and ECM (collagen I and fibronectin) reduced production. Then, the effect of hDPC-CM was assessed in cell viability and death by apoptosis in photoaged fibroblasts. Results indicated that hDPC-CM stimulated cell survival with protective effect against UVB-induced cell death by apoptosis. Regarding ECM production, hDPC-CM was able to partially recover the decreased fibronectin expression by photoaged fibroblasts, with no effect in collagen I production. Taken together, results suggest that DPC exerts paracrine effects in dermal fibroblasts during cutaneous repair, promoting cellular events that lead to wound closure, besides providing protection against photoaging, favoring the survival of photoaged fibroblasts. In addition, hDPC-EV are involved in the observed effects and point to the relevance of their exploration as a promising therapeutic tool for cutaneous repair.