Determinação do regulon putativo Zur de Leptospira interrogans sv. Copenhageni

Abstract

Leptospirosis is a cosmopolitan zoonosis of worldwide relevance and its etiologic agent is a bacterium of the genus Leptospira, which belongs to the order Spirochaetales. Definitive hosts are rodent mammals, but they may also have this characteristic, cattle and dogs. Humans are accidental or secondary hosts due to excessive contamination caused by poor sanitation and constant flooding in cities in underdeveloped countries due to poor infrastructure. Currently there is little information regarding the virulence of this bacterium and its regulation when placed in situations of stress or even inside the host. Zinc is one of the most important metal ions for bacteria due to their need for proteins (cofactor and/or structural). The regulation of the uptake and storage of this ion for bacteria is mediated mainly by proteins belonging to the family of transcriptional regulators called Fur (Ferric Uptake Regulator). This work aims to identify genes regulated by the Zur protein (Zinc Uptake Regulator) in response to zinc availability. There are four uncharacterized or little known paralogs of the Fur family regulators present in the genome of Leptospira interrogans sv. Copenhageni having been identified in this study the probable transcriptional regulator Zur and its respective regulon. We aligned the four paralogs with Zur regulators already described from other bacteria in order to define the best candidate to be the putative Zur regulator in the present model and in silico analyzes were performed in search of genes present in the genome that could present Zur-dependent regulation, using putative elements of ABC (ATP-Binding Cassette) type uptake systems as primary search evaluators. Three possible consensuses for the Zur binding site in the genes were used. The results found in this study identified coding genes for components of ABC uptake system without a predicted function using the consensus of Zur-box of Actinobacteria, a group close related to the Spirochetes order of which it belongs the genus Leptospira spp. A pab1703 gene coding for an ABC system element was chosen from those in the list of genes putatively regulated by Zur, in addition to the putative zur itself, encoded by LIC20147, to have their promoter regions used in the EMSA (Electrophoretic Gel Mobility Assay ) to verify the interaction between the probe and the putative protein Zur. Initial results showed that there was no binding of purified Zur to the probes in the tested conditions and therefore more studies are needed to elucidate the Zur regulon of L. interrogans.

Leptospirose é uma zoonose cosmopolita de relevância mundial, e seu agente etiológico é uma bactéria do gênero Leptospira, que pertence à ordem Spirochaetales. Hospedeiros definitivos são mamíferos roedores, porem podem também ter essa característica, bovinos e cães. Os seres humanos são hospedeiros acidentais ou secundários devido à contaminação excessiva acarretada por péssimas condições de saneamento básico e enchentes constantes em cidades de países subdesenvolvidos devidas a má infra-estrutura. Atualmente existem poucas informações em relação à virulência desta bactéria e sua regulação quando colocada em situações de estresse ou mesmo dentro do hospedeiro. O zinco é um dos íons metálicos mais importantes para bactérias devido a sua necessidade para funcionamento das proteínas (cofator e/ou estrutural). A via de regulação da captação e estoque desse íon para as bactérias é mediada principalmente por proteínas pertencentes à família de reguladores transcricionais que recebe o nome de Fur (Ferric Uptake Regulator). Este trabalho tem como objetivo identificar genes regulados pela proteína Zur (Zinc Uptake Regulator) em resposta a disponibilidade a zinco. Existem quatro parálogos não caracterizados ou pouco conhecidos da família Fur presentes no genoma de Leptospira interrogans sv. Copenhageni tendo sido identificado neste estudo o provável regulador transcricional Zur e seu respectivo regulon neste microrganismo de estudo. Foram alinhados os quatro parálogos com reguladores Zur já descritos de outras bactérias com o objetivo de definir o melhor candidato para ser o putativo regulador Zur no presente modelo e foram feitas analise in silico em busca de genes presentes no genoma da bactéria, que pudessem apresentar uma regulação Zur-dependente, utilizando putativos elementos de sistema de captação do tipo ABC (ATP-Binding Cassete) como avaliadores primários da busca. Foram usados três possíveis consensos para o sitio de ligação de Zur nos genes. Os resultados encontrados neste trabalho identificaram genes codificantes para componentes de sistema de captação ABC sem uma função predita apenas quando utilizado o consenso de Zur-Box de Actinobacteria, grupo aparentado as Espiroquetas, ordem que pertence o gênero Leptospira spp. Um gene, pab1703, codificante para um elemento do sistema ABC, foi escolhido dentre a lista de genes putativamente regulados por Zur, além do Zur, codificado por LIC20147, para terem suas regiões promotoras utilizadas no EMSA (Ensaio de mobilidade eletroforetica em gel) para verificar a interação entre a sonda e a proteína putativa Zur.