Engenharia de nicho hematopoiético: avaliação de um sistema de cultura tridimensional de células-tronco mesenquimais da placenta humana em arcabouços de poli(metacrilato de metila)(PMMA)

Abstract

No contexto da engenharia de tecidos, as novas propostas têm em vista a recriação dos microambientes biológicos (nichos) onde residem as células-tronco (CTs) in vivo, em particular os nichos hematopoiéticos onde as células-tronco progenitoras hematopoiéticas (CTPHs) são naturalmente expandidas. Sistemas de cultivo celular tridimensionais (3D) baseados em arcabouços poliméricos, têm sido empregados com a finalidade de controlar os processos de multiplicação e diferenciação dessas células in vitro. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e avaliação de um sistema de cultivo 3D de células- tronco mesenquimais da placenta humana (CTMs-PH) como possível modelo de nicho hematopoiético in vitro para o estudo da fisiologia da hematopoiese, e em particular para a expansão ex vivo das CTPHs para transplante. Para isso, as células foram isoladas, da região das vilosidades coriônicas da placenta humana (n=3) onde se encontram os nichos hematopoiéticos nesse órgão durante o desenvolvimento embrionário, pela capacidade da adesão ao plástico de cultivo. As células foram, então, caracterizadas morfologicamente e funcionalmente como sendo fibroblastóide, com potencial de diferenciação nas linhagens mesodermais adipogênica e osteogênica e com capacidade de formar colônia (CFC) quando semeadas em baixa densidade obtendo em média 5 ± 4,546, 15,83 ± 3,488, 3,75 ± 2,872 colônias nas amostras 1, 2 e 3, respectivamente. Todavia, foram realizados ensaios de curvas de proliferação para avaliar o comportamento da multiplicação das células em cultivo em função do tempo, observando um padrão de duas fases na cinética de multiplicação. Por outro lado, as CTMs-PH foram capazes de ser transfectadas com o plasmídeo pCX-EGFP, que contém um inserto do gene da proteína verde fluorescente (GFP), através da metodologia de eletroporação, utilizando o sistema comercial Neon® Transfection System. Para tal, 5 x 104 células foram submetidas a tratamentos com dois protocolos denominados A (1 pulso de 20 ms de 1700 V) e, B (1 pulso de 40 ms de 990 V) utilizando concentrações de 1 ou 2 µg de DNA plasmídico, e comparados através da quantificação da fluorescência, sendo a configuração do protocolo B com 1 µg de DNA a condição de maior eficiência relativa de transfecção. Ainda, foi possível padronizar a confecção de arcabouços de poli(metacrilato de metila) (PMMA) com valores calculados do tamanho de poros de 875,1 ± 231,9 µm, 1424 ± 310,3 µm e 1832 ± 260,1 µm, porosidade média de 75,14%, 73,49% e 71,71%, respectivamente, e módulo de Young controlável mediante a utilização de um sistema de fusão de cristais de NaCl em ambiente úmido. Finalmente, foi possível cultivar as CTMs-PH nos arcabouços de PMMA com os três tamanhos de poros. Através das técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal foi observado que as CTMs-PH apresentaram uma distribuição 3D no interior dos arcabouços, com boa capacidade de adesão e possivelmente com depósitos de moléculas de matriz extracelular. Com base nos resultados, conclui-se que este sistema de cultivo 3D de CTMs-PH em arcabouços de PMMA representa um modelo atrativo para futuras avaliações de expansão ex vivo de CTPHs.

Abstract : In the context of tissue engineering, the current proposals aim for the mimicking the biological microenvironments where the stem cells (SCs) reside in vivo, particularly the hematopoietic stem cells niche in which the hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) are naturally expanded, by through the engineering of three-dimensional (3D) scaffolds based on biomaterials. This in order to control the processes of self-renewal and differentiation of these cells in vitro. This study is focused on the development and evaluation of a 3D culture system of human placenta derived mesenchymal stem cells (P-MSCs) as a possible model of hematopoietic niche in vitro for the study of the physiology of hematopoiesis, and in particular for the ex vivo expansion of the HSPCs for transplantation. For this purpose, mesenchymal stem cells were isolated based on their culture plastic adhesion from the chorionic villi of the human placenta (P-MSCs) (n=3) which compose the HSPCs niche throughout embryonic development. Cells were then morphologically and functionally characterized as fibroblastóide-like morphology exhibiting capability to differentiate into adipogenic and osteogenic mesodermal linages and in still they show ability to form colonies at a low density of seeding cells obtaining 5 ± 4.546, 15.83 ± 3.488, 3.75 ± 2.872 colonies from samples 1, 2 and 3 respectively. In addition, growth curve assays were performed to evaluate the kinetics of the cell?s proliferation in culture showing a two-phase pattern in multiplication kinetics. Further, the P-MSCs was able to be transfected with a pCX-EGFP plasmid which contain the fluorescent green protein (GFP) gene insert through electroporation methodology by using the Neon® Transfection System. For this, 5 x 104 cells were treated with two differences protocols designed A (1 pulse of 20ms, 1700V) and B (1 pulse of 40ms, 990V) with 1 or 2 µg of plasmid DNA per 10µL volume reaction, and compared by using fluorescence quantification, resulting the configuration of protocol B with 1 µg of DNA the condition of superior efficiency of transfection. In addition, it was possible to standardize the fabrication of poly(methyl methacrylate) (PMMA) scaffolds with pore size of 875,1 ± 231,9 µm, 1424 ± 310,3 µm and 1832 ± 260,1 µm, porosity of 75,14%, 73,49% e 71,71% respectively and a controllable compression modulus using a salt fusion method. Finally, it was possible to culture the P-MSCs in the PMMA scaffolds of the three different pore sizes. By using a scanning electron microscopy (SEM) and confocal microscopy it was observe that the P-MSCs acquire a real 3D distribution within the PMMA scaffolds, having good adhesion capacity and likely deposit of extracellular matrix molecules. So, based on the results it is concluded that this 3D culture system of P-MSCs in PMMA scaffolds represents an attractive model for future valuations of ex-vivo expansion of HSPCs.