Investigação de diferentes mecanismos apoptóticos induzidos por compostos de origem natural e sintética em células de neoplasias hematológicas

Abstract

As leucemias agudas são neoplasias malignas do sistema hematopoiético associadas a milhares de óbitos em todo o mundo. No presente trabalho foi avaliado o efeito citotóxico de 70 novas chalconas sintéticas e do composto natural GE1, uma quinona isolada de Eugenia hiemalis; e seus mecanismos de ação foram investigados em células de leucemia aguda. Inicialmente foram selecionadas as chalconas mais citotóxicas (JA3 e JA7) e foi demonstrado, pelo método do MTT, que, assim como GE1, os compostos reduziram a viabilidade celular de diferentes linhagens tumorais de maneira dependente do tempo e da concentração. Os três compostos apresentaram altos índices de seletividade e não apresentaram citotoxicidade significativa sobre células não neoplásicas. JA3, JA7 e GE1 bloquearam o ciclo celular de células K562 e Jurkat e diminuíram a expressão do marcador de proliferação celular KI67. A morte por apoptose foi confirmada pela avaliação da morfologia celular, pelo ensaio de fragmentação do DNA e por citometria de fluxo pelo método da anexina-V. Os compostos aumentaram a produção de EROS, diminuíram a expressão das proteínas antiapoptóticas Bcl-2 e Bcl-xL e aumentaram a expressão das proteínas pró-apoptóticas Bax e Bak. Isso levou a um extenso dano mitocondrial manifestado pela perda do ??m e liberação de fatores apoptogênicos como AIF e citocromo c. Além disso, os compostos aumentaram a expressão de FasR, diminuíram a expressão de survivina e induziram a clivagem de caspase-3 e PARP. A morte celular induzida por JA3 e JA7 envolve ainda o estresse no RE e um tipo imunogênico de apoptose. A prevenção do estresse no RE ou o bloqueio da maquinaria pró-apoptótica inibiu a morte celular mediada por JA3 e JA7, assim como o bloqueio da via Fas com a superexpressão de c-FLIP ou com o inibidor de caspase 8. Finalmente, a associação dos três compostos com citarabina e vincristina aumentou o efeito antileucêmico desses fármacos quando comparado aos compostos isolados. Os resultados apresentados fornecem novas informações sobre os mecanismos de morte dos compostos JA3, JA7 e GE1 e sugerem que os mesmos possam vir a representar alternativas promissoras ao tratamento convencional para as leucemias agudas.

Abstract : Acute leukemias are malignant neoplasms of the hematopoietic system associated with thousands of deaths worldwide. In this study, it was evaluated the cytotoxic effect of 70 new synthetic chalcones and of the natural compound GE1, a quinone isolated from Eugenia hiemalis, and their death mechanisms were further investigated in acute leukemia cells. Initially, the most cytotoxic chalcones (JA3 and JA7) were selected and it was demonstrated, by the MTT method, that the compounds reduced the cell viability of different tumor cell lines in a concentration and time dependent manner. The three compounds were highly selective towards acute leukemia cells and were not significantly cytotoxic to non-neoplastic cells. JA3, JA7 and GE1 blocked the cell cycle of K562 and Jurkat cells and decreased the expression of the cell proliferation marker KI-67. Apoptotic cell death was confirmed by cell morphology, by DNA fragmentation and by flow cytometry using the annexin-V method. The results demonstrated that the compounds increased ROS production, decreased the expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL and increased the expression of pro-apoptotic proteins Bax and Bak. This resulted in an extensive mitochondrial damage manifested by ??m loss and by the release of apoptogenic factors such as AIF and cytochrome c. In addition, the compounds increased FasR expression, which also suggests the involvement of the extrinsic pathway, decreased survivin expression and induced caspase-3 and PARP cleavage. Cell death induced by chalcones JA3 and JA7 also involves ER stress and an immunogenic type of apoptosis. Preventing ER stress or blocking the positive regulation of the pro-apoptotic machinery inhibited JA3 and JA7-induced cell death, as well as the blockage of the Fas pathway by c-FLIP overexpression or by caspase-8 inhibitor. Finally, the association of the three compounds with the drugs cytarabine and vincristine increased the antileukemic effect of these drugs when compared to the isolated compounds. The results provide novel insights about the mechanisms involved in cell death induced by JA3, JA7 and GE1 and suggest that they might represent promising alternatives to conventional treatment for acute leukemia.