Compostos anti-biofilme: estudo in vitro em biofilmes mono e multi-espécies

Abstract

Objetivos: O presente estudo tem como objetivo avaliar a citotoxicidade das lactamas em queratinócitos orais humanos (HOK-18A) e sua atividade anti-biofilme contra biofilmes mono e multi-espécie, constituídos por 14 cepas bactérias da microbiota oral. Materiais e métodos: O efeito citotóxico das lactamas foi avaliado através do teste XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] em queratinócitos orais humanos (HOK-18A). Para os testes de atividade anti-biofilme, as lactamas foram testadas contra 5 espécies colonizadoras iniciais, 6 patógenos orais e 3 cepas comensais. Os testes em biofilme mono-espécie foram realizados através do protocolo fixação com etanol e coloração com cristal violeta. Os testes multi-espécie foram realizados em um biofilme complexo multi-espécies derivado de um biorreator. Tanto o crescimento planquitônico quanto a formação de biofilme foram mensurados através de q-pcr. Adicionalmente, o efeito das lactamas em biofilmes multi-espécie formado sobre duas superfícies diferentes também foi avaliado através de q-pcr. Resultados: De 26 lactamas testadas, 24 mantiveram mais de 50% de viabilidade celular após 24h de exposição e foram selecionadas para os testes seguintes. Em relação aos testes anti-biofilme mono-espécie, a maior parte das lactamas apresentou atividade de inibição do biofilme em S. oralis, S. sanguinis, A naeslundii, P. intermedia, P. gingivalis e F. nucleatum (p<0,05). Ainda, 9, 3 e 1 lactamas foram capazes de diminuir a formação de biofilme em A.a., S. mutans e S. sobrinus respectivamente (p <0,05). Em biofilmes multi-espécie, ainda que verifique-se um leve decréscimo na formação de biofilme em S. sanguinis, A. naeslundii, S. mitis e S. gordonii, apenas em P. gingivalis e P. intermedia a inibição foi estatísticamente significativa. Entretanto, quando testadas em discos de vidro, 7 espécies foram inibidas, enquanto apenas 2 em uma superfície de poliestireno. Conclusão: As lactamas demonstraram ser efetivas pelos resultados obtidos tanto nos ensaios de citotoxicidade como de inibição do biofilme mono-espécie, entretanto, o efeito inibitório no biofilme multi-espécies foi diminuído pela complexidade das interações bacterianas. Ainda que a maioria das lactamas não tenha atividade inibitória em biofilmes multi-espécies em ambas as superfícies, devido à maior eficácia da lactama U12 em biofilmes em discos de vidro, pode-se sugerir que a superfície tem uma influência sobre o seu potencial.<br>

Abstract : Objectives: The present study aims to evaluate the cytotoxicity of human oral keratinocytes (HOK-18A) and its anti-biofilm activity against mono and multi-species biofilms of 14 bacterial strains of the oral microbiota. Materials and methods: The cytotoxic effect of lactams was assessed by XTT [2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] test in human oral keratinocytes (HOK- 18A). For the anti-biofilm activity tests, the lactams were tested against 5 initial colonizers species, 6 oral pathogens and 3 commensals strains. The tests on mono-species biofilm were performed through ethanol fixation protocol and crystal violet staining. The multi-species tests were performed on a derived-bioreactor multi-species complex biofilm. Both, planktonic growth and biofilm formation were quantified by q-pcr. Additionally, the effect of lactams on multi-species biofilms formed on two different surfaces was also evaluated by q-pcr. Results: 24 out of 26 lactams maintained more than 50% of viable cells after 24 hours of exposure and were selected for the following tests (p <0.05). Regarding mono-species anti-biofilm experiments, most of the lactams presented biofilm inhibition activity in S. oralis, S. sanguinis, A naeslundii, P. intermedia, P. gingivalis and F. nucleatum (p<0,05). Furthermore, 9, 3 and 1 lactams were able to decrease biofilm formation in A.a., S. mutans and S. sobrinus respectively (p<0.05). Although in multi-species biofilm, a slight decrease in the biofilm formation can be observed in S. sanguinis, A. naeslundii, S. mitis and S. gordonii, only in P. gingivalis and P. intermedia, the inhibition was statistically significant. However, when tested on glass disks, 7 species were inhibited while only 2 on a polystyrene surface. Conclusion: Lactams proved to be successful by the results obtained both in the cytotoxic and mono-especies biofilm inhibition assays. However the anti-biofilm effect in multi-species biofilm was decreased by the complexity of bacterial interactions. Although most of lactams did not have anti-biofilm activity against multi-species biofilms on both surfaces. Due to the higher effectiveness of the lactam U12 was only on glass discs biofilms, it can be suggested that surface have an influence on its potential.