Desenvolvimento e avaliação in vitro das atividades antimicrobiana e citotóxica de nanopartículas de própolis para potencial uso intramamário

Abstract

A mastite bovina representa um importante entrave na cadeia produtiva do leite que afeta tanto a qualidade como a quantidade de leite produzido, acarretando em importantes prejuízos econômicos. Na maioria das vezes, a mastite é causada por bactérias, com destaque para Staphylococcus aureus. Desse modo, o objetivo do presente estudo foi o desenvolvimento de nanopartículas de própolis e a avaliação in vitro do seu potencial para o tratamento da mastite bovina causada por Staphylococcus aureus. O estudo compreendeu o desenvolvimento de três suspensões de nanopartículas de própolis (NP-1, NP-2 e NP-3), variando a proporção de surfactantes na sua composição, por meio da técnica de difusão do solvente a quente. As nanopartículas de própolis foram avaliadas quanto ao tamanho de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, pH, morfologia e quanto à estabilidade ao longo de 150 dias. O teor de fenólicos totais e a eficiência de encapsulação também foram avaliados. A atividade antimicrobiana das nanopartículas de própolis foi determinada in vitro pela técnica de microdiluição em caldo. A citotoxicidade das nanopartículas em células da glândula mamária bovina da linhagem MAC-T foi determinada pelo método do Brometo de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolil (MTT). As nanopartículas mantiveram-se estáveis durante todo o período avaliado. Todas apresentaram formato esférico, pH entre 3,9 e 4,2 e distribuição monodispersa (PDI < 0,2). O tamanho médio de partícula foi de 194,2, 181,2 e 201,0 nm, respectivamente, para as nanopartículas NP-1, NP-2 e NP-3. O teor de fenólicos totais variou de 145 a 167 µg equivalentes de ácido gálico/mg e a eficiência de encapsulação foi de 73% (NP-1), 88% (NP-2) e 91% (NP-3). As suspensões de nanopartículas de própolis apresentaram atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus, com valores de concentração inibitória mínima (MIC) de 156 µg/mL para as nanopartículas NP-1 e NP-3 e 310 µg/mL para a nanopartícula NP-2. No estudo de citotoxicidade in vitro, os valores de concentração inibitória 50% (IC50) das suspensões foram 159,1, 122,2 e 159,1 µg/mL para as nanopartículas NP-1, NP-2 e NP3, respectivamente. Com isso, o presente trabalho mostrou que a própolis nanoestruturada representa uma alternativa promissora para a obtenção de sistemas naturais contendo altas concentrações de extrato em meio aquoso, estáveis por considerável período de tempo. Entretanto, a composição das formulações de nanopartículas pode resultar em características físico-químicas e respostas biológicas diferentes. A atividade antimicrobiana apresentada pelas nanopartículas veio acompanhada de efeitos citotóxicos, influenciados pela concentração e pela formulação, sugerindo cautela no seu uso e aplicação na terapêutica da mastite bovina.

Abstract : Bovine mastitis remains an important obstacle to the milk production chain that affects both the quality and the quantity of milk produced, leading to significant economic losses. Mostly, mastitis is caused by bacteria, especially Staphylococcus aureus. Thus, the objective of the present study was the development of propolis nanoparticles and the in vitro evaluation of their potential for the treatment of bovine mastitis caused by Staphylococcus aureus. The study comprised the development of three suspensions of propolis nanoparticles (NP-1, NP- 2 and NP-3), varying the proportion of surfactants in their composition, through the hot solvent diffusion technique. Propolis nanoparticles were evaluated for particle size, polydispersity index, zeta potential, pH, morphology and stability over 150 days. Total phenolic content and encapsulation efficiency were also evaluated. The antimicrobial activity of propolis nanoparticles was determined, in vitro, by the broth microdilution technique. The cytotoxicity of the nanoparticles to MAC-T bovine mammary epithelial cells was determined by the MTT method (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolyl bromide). The nanoparticles remained stable throughout the period evaluated. All presented spherical shape, pH between 3.9 and 4.2 and monodisperse distribution (PDI <0.2). The mean particle size was 194.2, 181.2 and 201.0 nm, respectively, for the NP-1, NP-2 and NP-3 nanoparticles. The total phenolic content ranged from 145 to 167 µg gallic acid equivalent / mg and the encapsulation efficiency was 73% (NP-1), 88% (NP-2) and 91% (NP-3). Suspensions of propolis nanoparticles showed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, with minimum inhibitory concentration (MIC) of 156 µg / mL for NP-1 and NP-3 nanoparticles and 310 µg / mL for NP-2 nanoparticle. In the in vitro cytotoxicity study, the 50% inhibitory concentration values (IC50) of the suspensions were 159.1, 122.2 and 159.1 µg / mL for NP-1, NP-2 and NP3 nanoparticles, respectively. With this, the present work showed that nanostructured propolis represents a promising alternative for the obtaining of natural systems containing high concentrations of extract in aqueous medium, stable for a considerable period of time. However, the composition of the nanoparticle formulations may result in different physicochemical characteristics and biological responses. The antimicrobial activity presented by the nanoparticles was accompanied by cytotoxic effects, influenced by the concentration and the formulation, suggesting caution in its use use and application in the treatment of bovine mastitis.