Silenciamento dos genes antiapoptóticos BCL-2 e BCL-xL por RNA de interferência carreado por nanopartículas híbridas em câncer de mama

Abstract

O câncer consiste em um conjunto multifatorial de doenças e está entre as maiores causas de morbidade e mortalidade no mundo. O de mama é o segundo tipo de câncer mais comum, ocupando o primeiro lugar considerando apenas o gênero feminino. O desenvolvimento da doença está fortemente associado ao desequilíbrio dos mecanismos genéticos de proliferação celular, entre eles os que controlam os mecanismos de sobrevivência e morte celular, como a apoptose. A expressão dos genes BCL-2 e BCL-xL resulta na promoção da sobrevivência celular pela inibição da apoptose e no câncer de mama estes genes encontram-se superexpressos. Assim, além dos tratamentos existentes, uma nova abordagem de combate a doença seria o silenciamento de genes com expressão exacerbada. Para silenciar genes tem sido descrito o uso de pequenos RNAs de interferência (siRNA). No entanto, existem algumas limitações para a aplicação de siRNAs, como a baixa estabilidade e dificuldade de internalização pelas células alvo, fomentando a necessidade de vetores para promover a entrega do ácido nucleico. Neste estudo, duas formulações de nanopartículas híbridas CaP-siRNA-PEG-GLU poliânion foram desenvolvidas para promover a entrega, in vivo e in vitro, de siRNA para células de câncer de mama para silenciar os genes antiapoptóticos BCL-2 e BCL-xL. Os objetivos foram avaliar se os sistemas nanocarreadores seriam eficientes na entrega de siRNA ao alvo e se o silenciamento destes genes reduziria a viabilidade das células tumorais de carcinoma mamário, aumentariam a apoptose e seriam capazes de inibir o crescimento tumoral. Para isto, as formulações foram testadas em cultura de células humanas de carcinoma mamário (MCF-7) e em modelo tumoral murino (Balb/c). Os resultados obtidos quanto à caracterização das nanopartículas desenvolvidas, mostraram que estas apresentam tamanho e aspecto estrutural adequado para a entrega de ácidos nucleicos. As formulações também demonstraram homogeneidade e estabilidade em soluções tampões, meio de cultura e salina, propriedades importantes para aplicações biológicas. Tanto os ensaios in vitro quanto os in vivo, mostraram que após a incubação com os sistemas nanocarreadores, a expressão dos genes BCL-2 ou BCL-xL foi reduzida. Ainda, as sequências de siRNAs utilizadas induziram, in vitro, a morte de células tumorais por apoptose. Como as proteínas alvo deste estudo são relacionadas com a resistência aos medicamentos quimioterápicos, as formulações também foram testadas na presença de doxorrubicina. Os resultados mostraram diminuição significativa na CC50 deste fármaco, em incubação combinada com o silenciamento dos genes antiapoptóticos BCL-2 ou BCL-xL. Os resultados dos ensaios in vivo mostraram que a formulação contendo siRNA-BCL-2 inibiu o crescimento tumoral no modelo murino de câncer de mama após 14 dias de tratamento. Adicionalmente, os resultados demonstraram que as nanopartículas híbridas CaP-PEG(GLU)-Poliânion são seguras para administração endovenosa e foram eficientes em promover a entrega de siRNA ao tecido tumoral. Em conclusão, o silenciamento de genes antiapoptóticos BCL-2 e BCL-xL através do uso de siRNA carreado por nanopartículas híbridas CaP-PEG(GLU)-Poliânion, mostrou que pode ser uma estratégia promissora contra o câncer de mama, especialmente quando combinada com a quimioterapia padrão.

Abstract : Cancer is among the major causes of morbidity and mortality worldwide and breast cancer stands out by the epidemiological importance because it is the second most common cancer, ranking first considering only the female gender. The development of cancer clearly related with an imbalance of genetic mechanisms of cell proliferation, including those that control the survival mechanisms and cell death, such as apoptosis. Expression of BCL-2 or BCL-xL genes results in the promotion of cell survival by the inhibition of apoptosis. Thus, a novel approach to silence anti-apoptotic genes in cancer context, is the use of small interfering RNAs (siRNA). However, there are some limitations to apply siRNAs, such as low stability and difficulties of internalization by target cells, pointing out to the need for vectors to promote nucleic acid delivery. In this study, hybrid nanoparticles CaP-siRNA-PEG-GLU-polyanion were developed to promote both in vivo and in vitro delivery of siRNA to breast cancer cells. Facing this scenario, the objectives of this work were to evaluate whether the nanocarrier systems would be efficient to deliver siRNA to the target and whether the silencing of these genes would reduce the viability of mammary carcinoma tumor cells, increasing apoptosis. It has also been tested whether the formulations were able to inhibit tumor growth in tumor-bearing mice. To achieve this, the formulations were tested against human mammary carcinoma cell culture (MCF-7) and murine solid tumor model (Balb/c). Regarding the characterization of the nanoparticles the results showed suitable size and structural aspect to the therapeutic strategy.A homogeneity and stability of nanoparticles in buffer solutions, culture medium, and saline were also obtained, which is an important feature for biological applications. Additionally, both the in vitro and in vivo assays showed that the incubation with tested nanocarrier systems decreased the expression of BCL-2 or BCL-xL genes. The siRNA sequences applied also induced in vitro cytotoxicity in tumor cells increasing apoptosis. Once the targeted proteins are related to drugs resistance, the nanocarriers systems were also tested in the MCF-7 cells in the presence of doxorubicin. The results showed a significant reduction in CC50 of the drug, in combined incubation with nanoparticles loading siRNA. The results obtained with the formulation loading siRNA-BCL-2 in murine tumor model assays showed inhibition of tumor growth after 14 days of treatment. The hybrid CaP-PEG(GLU)-Polyanion nanoparticles were demonstrated to be safe for intravenous administration and are efficient in promoting the delivery of siRNA to tumor tissue. In conclusion, the silencing BCL-2 or BCL-xL antiapoptotic genes through the use of siRNA loaded into hybrid nanoparticles were achieved successfully and may be a promising strategy against breast cancer, especially whether combined with standard chemotherapy.