Elucidação da morfo-histodiferenciação do desenvolvimento de protocormos e estruturas semelhantes a protocormos (ESPs) de espécies de Cattleya Lindl. micropropagadas

Abstract

O Bioma Mata Atlântica é um dos ecossistemas mais ricos em diversidade biológica, contudo é o mais ameaçado do planeta. O processo de devastação causado nesse bioma reduziu sua biodiversidade, afetando suas populações e comunidades como também a flora epifítica. As espécies utilizadas nessa pesquisa são epífitas pertencentes à família Orchidaceae, do gênero Cattleya Lindl., que estão diminuindo suas populações devido à fragmentação deste ecossistema. A conservação ex situ tem sido uma importante ferramenta para a conservação das espécies ameaçadas e a micropropagação permite a conservação destes recursos genéticos vegetais. No presente trabalho foram propostas três investigações relacionadas a morfo-histodiferenciação de orquídeas do gênero Cattleya. Com o objetivo de compreender os estádios referentes a germinação e formação de protocormo até a fase de plântula, estudou-se a germinação assimbiótica de sementes de orquídeas de Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb. f. ex Warner in vitro, caracterizando a diferenciação morfológica e histológica durante os processos de germinação e desenvolvimento dos protocormos até o estádio de plântula. Sementes C. amethystoglossa passaram pelo processo de desinfestação e foram inoculadas em meio de cultura MS/2. As análises revelaram que o embrião após intumescimento rompe a testa, caracterizando a germinação e constitui o protocormo, o qual, no desenvolvimento, apresenta-se com primórdios foliares, no ápice, e rizóides, na base. No estádio que surge a primeira raiz passa a constituir a plântula. Nesse estádio em que o protocormo passa a ser uma plântula e esta constituído pelas primeiras folhas, pode-se induzir a formação das estruturas semelhantes a protocormos (ESPs). Utilizando este processo, no capítulo II, foi objetivado investigar através de estudos morfológicos e histológicos a etapa de obtenção das ESPs utilizando o processo de indução de explantes foliares de Cattleya tigrina A. Rich. ex Beer. Como explantes foram utilizados folhas jovens de C. tigrina cultivadas in vitro, inoculadas com a face abaxial em contato com o meio de cultura baseado em MS e suplementado com a metade das concentrações de macro e micronutrientes, suplementado com 20 µM de TDZ para induzir a formação das ESPs. A regeneração destas estruturas teve origem epidérmica, iniciando na face abaxial da folha inoculada. A região basal dos explantes foi a que apresentou maior quantidade de regeneração das ESPs. Estas ESPs apresentavam rizóides, na sua base, com a função de obtenção de nutrientes. A proliferação destas ESPs aconteceu gradativamente e em estádios mais avançados foram mais numerosas e mais volumosas. Estas ESPs foram selecionadas e subcultivadas em meio de cultura isento de fitoreguladores. Com a obtenção destas ESPs, objetivou-se estudos relacionados a morfo-histodiferenciação das ESPs, sob diferentes concentrações de giberelina e sacarose, para regeneração ou desenvolvimento de C. tigrina. As análises revelaram que as ESPs submetidas ao tratamento suplementado com 5 g.L-1 de sacarose e 5 µM ácido giberélico (S5G5) apresentaram uma melhor resposta morfológica e histológica de diferenciação em relação aos outros tratamentos. Estas ESPs permaneceram com a coloração verde, com alongamento caulinar e primórdios foliares. Os tratamentos submetidos com 20 g.L-1 de sacarose (S20G0) e 20 g.L-1 de sacarose e 5 µM giberelina (S20G5), não foram eficientes na regeneração de plantas, observando necrose total e ou parcial das ESPs. Para isso foi proposto realizar análises bioquímicas, verificando o teor de amido, carboidratos totais, clorofila a e b, e carotenóides totais. A partir dos resultados foi constatado que o tratamento S20G0 apresentou as concentrações mais elevadas de teores de carboidrato e amido, remetendo para alta concentração de sacarose no meio. Os teores de clorofila a, b, total e carotenóides nos tratamentos S20G5 e S5G5 apresentaram diferenças significativas quando comparadas com o tratamento S20G0. Sugere-se que a alta concentração de sacarose no meio de cultura pode ter ocasionado redução nos teores de clorofila e consequentemente na fotossíntese. De acordo com os resultados obtidos, foi possível concluir que as ESPs suplementadas com 5 g.L-1 de sacarose e 5 µM de ácido giberélico estiveram mais aptas a formar plantas, pois apresentaram parte aérea alongada, com primórdios foliares. Com estes resultados foi possível elucidar processos de desenvolvimento de C. amethystoglossa, a partir da germinação, e de C. tigrina, a partir da indução para obtenção de ESPs. Análises comparativas das ESPs submetidas a diferentes concentrações de sacarose e giberelina mostraram que elevados níveis de sacarose, para regeneração das ESPs, podem vir a ocasionar necrose das ESPs. O meio suplementado com 5 g.L-1 de sacarose e 5 µM de ácido giberélico, através das análises morfo-histológicas e bioquímicas, revelou ser o mais eficiente para obtenção de plantas. <br>

Abstract: The Atlantic Forest biome is one of the richest ecosystems in biological diversity, yet it is the most endangered in the world. Devastation of this biome has diminished its biodiversity, affecting its populations and communities as well as the epiphytic flora. The species used in this research are epiphytic belonging to the Orchidaceae family, genus Cattleya Lindl., whose populations have declined due to the fragmentation of this ecosystem. Ex situ preservation has been an important tool for managing the preservation of endangered species, and micropropagation enables the preservation of plant genetic resources. In the present work, three investigations were proposed for the morpho and histodifferentiation of orchids of the genus Cattleya. Aiming to understand the stages relating to the germination and formation of protocorm until reaching the plantlet phase, nonsymbiotic in vitro germination of seeds of orchids Cattleya amethystoglossa Linden & Rchb. f. ex Warner was studied, characterizing the morphological and histological differentiation during the processes of germination and development of protocorms until the seedling stage. Seeds of C. amethystoglossa were disinfected and inoculated in a MS/2 culture. The analyses revealed that the embryo after swelling breaks the testa cell, characterizing germination, and constitutes the protocorm, which, during development, presents leaf primordia at the apex and rhizoids at the base. At the stage when the first root emerges, it becomes a plantlet. In this stage, in which the protocorm becomes a seedling and is constituted by the first leaves, one can induce the formation of protocorm-like bodies (PLBs). Using this process, in Chapter II, the objective was to investigate via morphological and histological studies the stage of PLBs development, using the process of induction of leaf explants of Cattleya tigrina A. Rich. ex Beer. As explants, young leaves of C. tigrina cultured in vitro were inoculated with the abaxial surface in touch with the MS medium and supplemented with half of the concentrations of macro and micro nutrients, supplemented with 20 µM of TDZ to induce the PLBs development. The regeneration of such structures had epidermal origin, starting on the abaxial surface of the inoculated leaf. The basal region of the explants presented the greatest PLBs regeneration. Such PLBs had rhizoids at their bases, with the function of obtaining nutrients. Proliferation of the PLBs occurred gradually and in the most advanced stages they were more numerous and voluminous. Such PLBs were selected and sub-cultured in culture medium free of plant growth regulators. Upon the development of the PLBs, the goal was to study the morpho and histodifferentiation of the PLBs under different concentrations of gibberellin and sucrose, for regeneration or development of C. tigrina. The analyses showed that the PLBs undergoing treatment supplemented with 5 g.L-1 of sucrose and de 5 µM of gibberellin acid (S5G5) presented the best morphological and histological differentiation response compared with other treatments. Such PLBs remained with a green color, with elongation of the shoots with leaf primordia. Treatments with 20 g.L-1 of sucrose (S20G0) and 20 g.L-1 of sucrose and 5 µM of gibberellin (S20G5) were not effective in the plants regeneration, and total or partial necrosis of the PLBs was found. As a result, it was suggested to conduct biochemical analyses to determine the concentrations of starch, total carbohydrates, chlorophyll a, b, total and carotenoids. The results showed that treatment S20G0 had the highest concentrations of carbohydrates and starch, attributable to the high concentration of sucrose in the medium. The levels of chlorophyll a, b, total and carotenoids in treatments S20G5 and S5G5 showed significant differences when compared with treatment S20G0. It is suggested that the high sucrose concentration in the culture medium might have caused the reduced amount of chlorophyll and, as a consequence, in photosynthesis. According to the results obtained, it was possible to conclude that the PLBs supplemented with 5 g.L-1 of sucrose and 5 µM of gibberellin acid were more efficient in forming plants, because they showed an elongated shoot with leaf primordia. With these results, it was possible to elucidate the development processes of C. amethystoglossa from germination and of C. tigrina from induction to develop PLBs. Comparative analyses of PLBs with different concentrations of sucrose and gibberellin showed that high levels of sucrose for PLBs regeneration might cause necrosis of the same. The morphological and histological analyses showed that the medium supplemented with 5 g.L-1 of sucrose and 5 µM of gibberellin acid was the most effective for the plants development.