Avaliação do efeito anti-inflamatório e antibacteriano da Lotus corniculatus v. São Gabriel

Abstract

A Lotus corniculatus (Fabaceae) é distribuída em muitas regiões do mundo e possui grande valor agronômico por seus constituintes: proantocianidinas, flavonoides e ácido oleanólico. Esta planta é utilizada como alimento para o gado proporcionando o aumento no ganho de peso e na produção de leite, além do controle de infecções intestinais parasitárias nos animais. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito anti-inflamatório e antibacteriano do extrato bruto (CE) da Lotus corniculatus v. São Gabriel, frações (hexano (HEX), acetato de etila (AcOEt), butanólica (BuOH) e resíduo aquoso (AF)), e compostos isolados (canferitrin, ácido oleanólico e ß-sitosterol). As partes aéreas da Lotus corniculatus foram secas a temperatura ambiente, e a partir desse material (620 g), foi extraído o extrato bruto (CE) por maceração com etanol 96% por um mês. O solvente foi evaporado resultando em 78 g de extrato bruto (CE). O extrato bruto foi fracionado por extração líquido-líquido utilizando solventes em ordem crescente de polaridade resultando nas frações hexano (HEX), acetato de etila (AcOEt), butanólica (BuOH) e resíduo aquoso (AF). A partir da fração HEX foram isolados o ácido oleanólico e o ß-sitosterol, e a partir da fração AcOEt o canferitrin. Para a avaliação da atividade anti-inflamatória foi utilizado o modelo de pleurisia induzida pela carragenina, em camundongos, e foram avaliados os seguintes parâmetros inflamatórios: concentrações de leucócitos, exsudação, atividade da mieloperoxidase (MPO) e da adenosina-deaminase (ADA), além das concentrações de nitrito/nitrato (NOx) e interleucina-1 beta (IL-1 ). Nesse protocolo experimental, foram utilizados camundongos albinos suíços, os quais foram distribuídos em diferentes grupos e tratados com CE (100 - 400 mg/kg), HEX (50 - 200 mg/kg), AcOEt (100 - 400 mg/kg), BuOH (50 - 200 mg/kg), AF (25 - 200 mg/kg), canferitrin (50 - 100 mg/kg), ácido oleanólico (10 - 100 mg/kg) ou ß-sitosterol (10 - 100 mg/kg) 0,5 h antes da administração da carragenina (1%, i.pl.). Os parâmetros inflamatórios foram avaliados 4 h após. Todos os animais, exceto nos experimentos que foram analisadas as atividades enzimáticas, foi administrado previamente (10 min.) Azul de Evans (25 mg/kg, i.v.) a fim de avaliar a exsudação. Dexametasona e indometacina foram utilizados como fármacos anti-inflamatórios de referência. Para a avaliação da atividade antibacteriana, foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM). Neste protocolo, o material vegetal, o extrato bruto (CE), frações e compostos isolados, foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) e transferidos para uma placa em diluição seriada e, a seguir, o inóculo bacteriano foi adicionado. Gentamicina foi utilizada como fármaco antibacteriano de referência. Diferenças estatísticas entre os grupos, para os parâmetros inflamatórios, foram determinadas pela análise dos testes t de Student ou de variância (ANOVA). Valores de P < 0,05 foram considerados significativos. O extrato bruto da Lotus corniculatus (200 - 400 mg/kg) e frações (50 - 200 mg/kg), assim como os compostos isolados (25 - 100 mg/kg) inibiram: leucócitos, neutrófilos, exsudação, a atividade da MPO e da ADA, além das concentrações de NO e IL-1 (P < 0,05). A indometacina e a dexametasona inibiram todos os parâmetros inflamatórios estudados (P < 0,05). Em relação à atividade antibacteriana, somente as frações HEX e AcOEt, e os compostos isolados ácido oleanólico e canferitrin, revelaram atividade bactericida e/ou bacteriostática. A fração HEX demonstrou moderada atividade antibacteriana (CIM = 100 µg mL-1) para a bactéria Bacillus cereus, e fraca atividade antibacteriana (CIM = 600 a 1000 µg mL-1) para as bactérias Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus epidermidis, Providencia alcalifaciens e Acinetobacter calcoaceticus. A fração AcOEt demonstrou fraca atividade antibacteriana (CIM = 800 µg mL-1) para as bactérias Enterococcus faecalis, Bacillus cereus e Acinetobacter calcoaceticus. O ácido oleanólico revelou boa atividade antibacteriana para Staphylococcus aureus meticilina resistente (CIM = 100 µg mL-1),Listeria monocytogenes e Bacillus cereus (CIM = 25 µg mL1), e o canferitrin demonstrou boa atividade antibacteriana para as bactérias: Staphylococcus epidermidis, Shigella flexinerii, Salmonella typhimurium e Acinetobacter calcoaceticus (CIM = 100 µg mL-1). Este composto demonstrou excelente atividade antibacteriana para as bactérias Enterococcus faecalis (CIM = 3.9 µg mL-1) e Bacillus cereus (CIM = 8.5 µg mL-1). O extrato bruto, frações e compostos isolados da Lotus corniculatus v. São Gabriel demonstraram importante atividade anti-inflamatória e antibacteriana. Os compostos isolados: canferitrin, ácido oleanólico e ß-sitosterol podem ser responsáveis por estes efeitos anti-inflamatório e/ou antibacteriano. The Lotus corniculatus (Fabaceae) is distributed in many regions of the world and has a high agronomic value for its constituted: proanthocyanidins, flavonoids and oleanolic acid. This plant is used as food for cattle providing the enhancement of the weight and of milk production beyond the control of intestinal parasitic infections in the animals. The aim of this study was to evaluate the anti-inflammatory and anti-bacterial effects of crude extract (CE), fractions (hexane (HEX), ethyl acetate (AcOEt), n-butanol (BuOH) and aquous fraction (AF)), and isolated compounds (kaempferitrin, oleanolic acid and ß-sitosterol) from Lotus corniculatus v. São Gabriel. The aerial parts of Lotus corniculatus were dried at room temperature and this material (620 g) the crude extract (CE) was extracted by maceration with ethanol 96% for one month. The solvent was evaporated resulting in 78 g of crude extract (CE). The crude extract was fractionated by liquid-liquid extraction using solvents in growing order of polarity resulting in hexane (HEX), ethyl acetate (AcOEt), n-butanol (BuOH) and aqueous fraction (AF). From the HEX fraction it was isolated the oleanolic acid and the ß-sitosterol and from AcOEt fraction the kaempferitrin. To evaluate the anti-inflamatory activity, it was used the mouse model of pleurisy induced by carrageenan and the following inflammatory parameters were evaluated: leukocytes, exudation, myeloperoxidase (MPO) and adenosine-deaminase (ADA) activities, as well as, nitrite/nitrate (NOx) and interleukin-1 beta (IL-1ß) levels. In this experimental protocol, swiss mice were used in the in vivo experiments, which were distributed in different groups and they were treated with CE (100 - 400 mg/kg), HEX (50 - 200 mg/kg), AcOEt (100 - 400 mg/kg), BuOH (50 - 200 mg/kg), RA (25 - 200 mg/kg), kaempferitrin (50 - 100 mg/kg), oleanolic acid (10 - 100 mg/kg) or ß-sitosterol (10 - 100 mg/kg) 0,5 h before carrageenan (1%,i.pl.). The inflammatory parameters were evaluated 4 h after. All animals, except in the experiments that were analyzed enzymatic activities, the animals were previously pretreated (10 min.) with Evans blue dye (25 mg/kg, i.v.) in order to evaluate the exudation. Dexamethasone and indomethacin were used as anti-inflammatory reference drugs. To evaluate the anti-bacterial activity, it was used the microdilution in broth technical to determine the minimal inhibitory concentraton (MIC) and the minimal bactericidal concentration (MBC) methodology. In this protocol the crude extract (CE), fractions and isolated compounds were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) and transferred to plate in serial dilution and, after, the bacterial inoculum were added. The gentamicin was used as the anti-bacterial reference drug. To the anti-inflammatory parameters, statistical differences between groups were determined by Student's t test and analysis of variance (ANOVA). Values of P < 0.05 were considered significant. The crude extract of Lotus corniculatus (200 - 400 mg/kg) and fractions (50 - 200 mg/kg), as well as its isolated compound (25 - 100 mg/kg) inhibited: lekocytes, neutrophils and exudation, the MPO and ADA activities, as well as NO and IL-1 levels (P < 0.05). Indomethacin and dexamethasone inhibited all the studied inflammatory parameters (P < 0.05). In regard to the anti-bacterial activity, only the HEX and AcOEt fractions and the isolated compounds, oleanolic acid and kaempferitrin, revealed anti-bacterial and/or bacteriostatic activities. The hexane fraction showed moderate anti-bacterial effect (MIC = 100 µg mL-1) on Bacillus cereus and weak anti-bacterial effect (MIC = 600 to 1000 µg mL-1) on Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus epidermidis, Providencia alcalifaciens and Acinetobacter calcoaceticus. The AcOEt fraction demonstrated a weak anti-bacterial activity (MIC = 800 µg mL-1) on Enterococcus faecalis, Bacillus cereus and Acinetobacter calcoaceticus.The Oleanolic acid, isolated from hexane fraction, exhibited a good anti-bacterial activity on methycillin-resistant Staphylococcus aureus (MIC = 100 µg mL-1), Listeria monocytogenes and Bacillus cereus (MIC = 25 µg mL-1) and the kaempferitrin, a compound isolated from this fraction, demonstrated a good anti-bacterial effect on: Staphylococcus epidermidis, Shigella flexinerii, Salmonella typhimurium and Acinetobacter calcoaceticus (MIC = 100 µg mL-1). This compound showed an excellent anti-bacterial activity on Enterococcus faecalis (MIC = 3.9 µg mL-1) and Bacillus cereus (MIC = 8.5 µg mL-1). The crude extract, fraction and isolated compound from Lotus corniculatus v. São Gabriel, demonstrated important anti-inflammatory and anti-bacterial activities. The isolated compounds: kampferitrin, oleanolic acid and ß-sitosterol can be responsible for these anti-inflammatory and/or anti-bacterial effects.