miR4415 em Fabaceae: evolução e relevância potencial na ferrugem asiática da soja

Abstract

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs endógenos não codificantes envolvidos no crescimento, desenvolvimento e respostas a estresses em plantas. miRNAs com distribuição restrita a determinadas linhagens evolutivas representam sistemas valiosos para investigar a diversificação de redes regulatórias, especialmente em grupos com histórico evolutivo complexo, como as espécies de plantas da família Fabaceae. Entre as leguminosas, o miRNA miR4415 tem despertado interesse devido à sua distribuição taxonômica restrita e à predição de regulação da ascorbato oxidase (AAO), enzima associada a respostas a estresses. No entanto, a diversificação evolutiva do miR4415 em Fabaceae e sua relevância funcional em espécies de alta importância agronômica, como por exemplo a soja (Glycine max), permanecem pouco compreendidas. Neste estudo, investigamos a diversificação evolutiva e o potencial papel regulatório do miR4415 em Fabaceae, com ênfase na relação miR4415 e AAO durante o desenvolvimento da Ferrugem Asiática da Soja (FAS) causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. Assim, foram realizadas análises de filogenia, sintenia e elementos cis-regulatórios em regiões promotoras, complementadas pela validação experimental do transcrito alvo do miR4415 e pela análise de cinética temporal da expressão de miR4415ab-3p e genes AAO durante a FAS. Nossos resultados corroboram o miR4415 como um miRNA restrito à família Fabaceae, com homólogos detectados nas subfamílias Papilionoideae e Caesalpinioideae. Análises de sintenia e variação no número de cópias de miR4415 indicaram expansão de seus loci em algumas espécies do gênero Glycine. Adicionalmente, a caracterização de elementos cis-regulatórios em regiões promotoras revelou diferenças na composição e abundância de sítios de ligação associados a distintas famílias de fatores de transcrição entre as espécies de Glycine, sugerindo diversificação regulatória entre grupos anuais e perenes. As análises de predição in silico dos alvos do miR4415 apontaram como alvos preditos as AAO3, AAO4, AAO5 e AAO6, enquanto a validação experimental comprovou a clivagens dos transcritos AAO3 e AAO5 pela sequência miR4415ab-3p. Durante a infecção por FAS, foram observados padrões de expressão inversos entre o miR4415ab-3p e seu alvos cognatos AAO5 e AAO3, com perfil semelhante para o transcrito da AAO4. Em conjunto, esses resultados ampliam o conhecimento sobre a diversificação evolutiva do miR4415 em leguminosas e fornecem evidências funcionais que sustentam a relevância da interação miR4415?AAO na resposta da soja à infecção por P. pachyrhizi.

Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are small endogenous non-coding RNAs involved in plant growth, development, and stress responses. miRNAs with distribution restricted to specific evolutionary lineages represent valuable systems for investigating the diversification of regulatory networks, particularly in groups with complex evolutionary histories, such as species within the Fabaceae family. Among legumes, miR4415 has attracted attention due to its restricted taxonomic distribution and predicted regulation of ascorbate oxidase (AAO), an enzyme associated with stress responses. However, the evolutionary diversification of miR4415 in Fabaceae and its functional relevance in agronomically important species, such as soybean (Glycine max), remain poorly understood. In this study, we investigated the evolutionary diversification and potential regulatory role of miR4415 in Fabaceae, with emphasis on the miR4415 AAO relationship during the development of Asian Soybean Rust (ASR), caused by the fungus Phakopsora pachyrhizi. To this end, phylogenetic, synteny, and cis regulatory element analyses in promoter regions were performed, complemented by experimental validation of miR4415 target transcripts and temporal expression profiling of miR4415ab-3p and AAO genes during ASR infection. Our results support miR4415 as a Fabaceae-restricted miRNA, with homologs detected in the Papilionoideae and Caesalpinioideae subfamilies. Synteny analyses and variation in miR4415 copy number indicated locus expansion in some species of the genus Glycine. Additionally, the characterization of cis-regulatory elements in promoter regions revealed differences in the composition and abundance of binding sites associated with distinct transcription factor families among Glycine species, suggesting regulatory diversification between annual and perennial groups. In silico target prediction analyses identified AAO3, AAO4, AAO5, and AAO6 as putative miR4415 targets, while experimental validation confirmed cleavage of AAO3 and AAO5 transcripts by miR4415ab-3p. During ASR infection, inverse expression patterns were observed between miR4415ab-3p and its cognate targets AAO5 and AAO3, with a similar profile also detected for the AAO4 transcript. Collectively, these findings expand current knowledge of miR4415 evolutionary diversification in legumes and provide functional evidence supporting the relevance of the miR4415 AAO interaction in soybean responses to P. pachyrhizi infection.