Análise do repertório de genes codificantes e identificação de fatores de virulência em cepa Crithidia sp. isolada de caso de coinfecção em leishmaniose cutânea

Abstract

A família Trypanosomatidae é composta por parasitas obrigatórios, incluindo gêneros que causam infecções em invertebrados e vertebrados em seu ciclo de vida, ocasionando casos clínicos de diferentes manifestações. As leishmanioses são manifestações causadas por múltiplas espécies do gênero Leishmania, porém casos clínicos recentes têm reportado a presença de tripanossomatídeos tipicamente monoxênicos tanto em manifestações de Leishmaniose Cutânea quanto Leishmaniose Visceral (LV). Em 2018, foi observado em Minas Gerais um caso de paciente com diagnóstico inicial para LTA, contudo após passagens em cultivo e investigação molecular também demonstrou a presença de tripanosomatídeos monoxênicos Crithidia sp. Para melhor caracterização desta cepa, foi realizada a avaliação do repertório gênico deste isolado de Crithidia sp. cepa Cr316 e a comparação com genomas de referência de Crithidia spp. e Leishmania spp., para compreender as diferenças gênicas e fatores de virulência que podem explicar a presença deste parasito no paciente. Assim, este estudo objetivou sequenciar, montar e anotar o genoma deste isolado de Crithidia sp. cepa Cr316, para comparar seu conteúdo gênico e avaliar a presença de genes de virulência conhecidos para Leishmania spp.. Para tal, foi realizado o sequenciamento do DNA pela abordagem de long reads por nanoporos (ONT). A partir destes, a montagem de novo do genoma deste isolado foi realizada utilizando o programa Medaka com uma cobertura de 328 vezes, totalizando 33,4 MB. A análise de completude pelo BUSCO demonstrou que menos de 3,8% dos genes esperados estavam ausentes neste genoma. Estes dados demonstram a obtenção de um genoma contíguo e completo para esta espécie. A partir da análise da estimativa de distância pôde ser inferido que a cepa Cr316 pertence ao gênero Crithidia e apresenta maior proximidade com C. fasciculata, embora com divergência em relação a C. fasciculata, o que sugere a possibilidade de se tratar de uma espécie distinta. Após a caracterização funcional das proteínas e análise das predições, puderam ser observadas expansões em grupos de proteínas com assinaturas consistentes com transporte de membrana/ATPases, quinases e proteínas de superfície, com a maior parte do proteoma de Crithidia sp. Cr316 sendo conservada em relação a C. fasciculata CfCl, esperado para um genoma de tripanossomatídeos. Foi possível observar a presença de 23 amastinas, 4 cisteínas proteases A, 10 GP63 e 18 HSPs, proteínas descritas como associadas à virulência em tripanossomatídeos dixênicos. Esse achado sugere a potencial presença de transcritos moleculares que favorecem a sobrevivência através de adaptações morfológicas ao ambiente de hospedeiro mamífero e suas defesas inatas, transcritos estes parcialmente convergentes com Leishmania. Contudo, a ausência dos genes A2, LPG-2 e, particularmente de CPB, indicam falta de mecanismos de evasão, supressão imune e de diferenciação celular para o sucesso do parasitismo em macrófago, sugerindo um provável oportunismo de Crithidia sp. Cr316 possivelmente dependente de mecanismos imunomoduladores induzidos por Leishmania spp. durante uma coinfecção.

Abstract: The Trypanosomatidae family consists of obligate parasites, including genera that infect both invertebrates and vertebrates during their life cycles, resulting in clinical cases with diverse manifestations. Leishmaniasis is caused by multiple species of the genus Leishmania; however, recent clinical cases have reported the presence of typically monoxenous trypanosomatids in cases of both Cutaneous Leishmaniasis and Visceral Leishmaniasis (VL). In 2018, a patient in Minas Gerais was initially diagnosed with tegumentary leishmaniasis; however, following culture passages and molecular investigation, the presence of the monoxenous trypanosomatid Crithidia sp. was also detected. To better characterize this strain, the gene repertoire of the Crithidia sp. isolate (strain Cr316) was evaluated and compared with reference genomes of Crithidia spp. and Leishmania spp. to understand the genetic differences and virulence factors that might explain the parasite's presence in the patient. Thus, this study aimed to sequence, assemble, and annotate the genome of the Crithidia sp. isolate (strain Cr316) to compare its gene content and assess the presence of virulence genes known in Leishmania spp. To achieve this, DNA sequencing was performed using the Nanopore (ONT) long-read approach. De novo genome assembly of the isolate was subsequently performed using the Medaka program, achieving 328x coverage and a total size of 33.4 Mb. Completeness analysis using BUSCO showed that less than 3.8% of expected genes were missing from the genome. These data demonstrate the successful generation of a contiguous and complete genome for this species. Based on the distance estimate analysis, it was inferred that strain Cr316 belongs to the genus Crithidia and is most closely related to C. fasciculata, although it shows divergence from the latter, suggesting it may be a distinct species. Functional characterization of proteins and analysis of predictions revealed expansions in protein groups with signatures consistent with membrane transport/ATPases, kinases, and surface proteins; however, the majority of the Crithidia sp. Cr316 proteome was conserved relative to C. fasciculata CfCl, as expected for a trypanosomatid genome. The presence of 23 amastins, 4 cysteine protease As, 10 GP63s, and 18 HSPs was observed?proteins associated with virulence in dixenous trypanosomatids. This finding suggests the potential presence of molecular transcripts that facilitate survival through morphological adaptations to the mammalian host environment and its innate defenses?transcripts that partially overlap with those found in Leishmania. However, the absence of A2 and LPG-2 genes, and particularly the CPB gene, indicates a lack of the mechanisms for immune evasion, immune suppression, and cellular differentiation required for successful parasitism within macrophages; this suggests that Crithidia sp. Cr316 is likely an opportunistic pathogen, possibly relying on immunomodulatory mechanisms induced by Leishmania spp. during co-infection.