Geração in vitro de mRNA de Flt3L: validação e Caracterização Fenotípica e Funcional de Células Dendríticas Murinas

Abstract

A oncoimunoterapia enfrenta desafios significativos frente a tumores "frios", caracterizados por microambientes imunossupressores que dificultam a resposta citotóxica. Nesse contexto, as células dendríticas (DCs), especialmente a subpopulação cDC1(células dendríticas convencionais do tipo 1), são essenciais para a apresentação cruzada (cross-presentation) de antígenos tumorais a linfócitos T CD8+. O presente estudo objetivou validar a funcionalidade biológica de um RNA mensageiro (mRNA) sintético codificante para o fator de crescimento Flt3L, derivado de design biocomputacional, visando a expansão e o direcionamento fenotípico de células dendríticas murinas derivadas de medula óssea (BMDCs) para o perfil cDC1 in vitro. A síntese do transcrito foi realizada por transcrição in vitro (IVT) a partir de plasmídeo linearizado, incorporando análogo de Cap e a base modificada 5-Metil-UTP para conferir estabilidade e evasão do sistema imune inato celular. Após o controle de qualidade por eletroforese automatizada, as BMDCs extraídas de camundongos BALB/c foram transfectadas utilizando vetorização lipídica (Lipofectamine) e maturadas com LPS e IFN-gamma. A caracterização fenotípica procedeu-se via citometria de fluxo e a competência funcional foi quantificada pela secreção de IL-12p70 por ELISA. A síntese gerou um mRNA de alta pureza e integridade máxima (RINe 10.0) e a imunofenotipagem demonstrou que a transfecção promoveu um enriquecimento consistente da subpopulação cDC1 (CD45+ CD11c+ XCR1+), que expandiu de uma frequência basal de 22% para 36%. Já as células transfectadas e estimuladas apresentaram secreção robusta de IL-12p70 (pico aproximado de 80 pg/mL), confirmando competência. O mRNA sintético de Flt3L se demonstrou altamente eficaz em induzir o desvio fenotípico direcional e a competência secretória das BMDCs, validando-o para futuras aplicações translacionais em oncoimunoterapia.