Papel do eixo intestino-cérebro na neuroinflamação tardia induzida pela proteína Spike do SARS-CoV-2 em camundongos

Abstract

A COVID Longa é uma condição que se apresenta meses ou anos após a fase aguda da infecção pelo SARS-CoV-2, de modo que um dos principais sintomas relatados por pacientes que se recuperam da fase aguda da COVID-19 são aqueles relacionados a função cognitiva, como dificuldade de concentração e aprendizado e perda de memória, sendo esse comprometimento cognitivo referido como névoa cerebral. Estudos não-clínicos conduzidos previamente avaliaram o efeito da exposição local à proteína Spike do vírus sobre o parênquima encefálico, o que reforçou a hipótese da participação da reatividade tardia de células da glia como o principal componente fisiopatológico responsável pelo comprometimento cognitivo na COVID Longa. Tendo em vista a necessidade translacional de avaliar o efeito da exposição sistêmica à proteína Spike sobre o sistema nervoso central (SNC), este estudo tem como objetivo investigar a hipótese de que a perturbação do eixo intestino-encéfalo pela exposição sistêmica a este componente viral contribui para neuroinflamação e declínio cognitivo tardio, o que seria acompanhado do aumento da permeabilidade das barreiras intestinal e hematoencefálica (BHE), facilitando a translocação de lipopolissacarídeo de origem entérica para a circulação sistêmica e, posteriormente para o SNC, atuando em sinergismo com a Spike. Dessa forma, neste estudo camundongos C57BL/6 machos e fêmeas foram divididos em três grupos experimentais e expostos sistemicamente a proteína Spike em sua forma ativa ou desnaturada (10 µg/100 µL; s.c) ou somente veículo (PBS, 100 µL; s.c). A partir do 3º e 30º dias pós-infusão (d.p.i) os animais foram submetidos aos testes comportamentais que representaram a fase aguda e tardia, respectivamente, tendo um intervalo de 23 dias entre cada uma das fases. Foram conduzidos testes de campo aberto (CA), reconhecimento de objeto novo (RON), labirinto em Y (LY) e labirinto aquático de Morris (LAM), discriminação olfatória (DO), labirinto em cruz elevado (LCE) e caixa claro/escuro (CCE). A permeabilidade da barreira intestinal foi avaliada funcionalmente através do extravasamento de isotiocianato de fluoresceína (FITC) ? dextrano e indiretamente por meio da mensuração dos níveis de LPS no soro, enquanto que a BHE foi avaliada por meio do extravasamento do corante Azul de Evans para o encéfalo. Após a eutanásia amostras de hipocampo e íleo foram coletadas e destinadas a mensuração de parâmetros inflamatórios e oxidativos. Além disso, foi realizada a análise histopatológica e morfométrica dos tecidos encefálico e entérico, bem como a determinação dos níveis de mucinas no íleo. Os resultados revelam que exposição sistêmica a proteína Spike provocou um comprometimento da atividade locomotora e exploratória no teste de CA de forma aguda em fêmeas, o que pode indicar o suposto comportamento de doente devido a inflamação sistêmica causada durante esse período, o qual não foi observado na fase tardia. Da mesma forma, fêmeas apresentaram características relacionadas ao comportamento do tipo-ansioso na fase aguda no teste de CCE, resultado que se manteve na fase tardia e foi observado também no LCE. Já em relação a função cognitiva, tanto machos quanto fêmeas apresentaram um comprometimento cognitivo, o que foi evidenciado pelos testes de RON e LAM. Tanto o comportamento do tipo-ansioso em fêmeas quanto o comprometimento cognitivo observado em ambos os sexos podem estar relacionados com o provável efeito neuroinflamatório e neuro-oxidativo evidenciado no hipocampo de machos e fêmeas de forma tardia. Machos e fêmeas apresentaram um perfil inflamatório e oxidativo em amostras de íleo, assim como uma alteração morfométrica na histoarquitetura do tecido. De forma interessante, somente as fêmeas apresentaram um aumento da permeabilidade intestinal, o que pode explicar os níveis séricos aumentados de LPS, enquanto machos mantiveram preservada a integridade dessa barreira fisiológica. De forma semelhante, foi observado um aumento da permeabilidade da BHE somente em fêmeas. Em conclusão, fica evidente o dimorfismo sexual em relação a exposição sistêmica a Spike sobre parâmetros comportamentais, bem como o possível mecanismo por trás de tais achados e do declínio cognitivo em ambos os sexos, de modo que tais alterações e os efeitos inflamatórios e oxidativos nas fêmeas foi acompanhado de um comprometimento das barreiras intestinal e hematoencefálica, podendo indicar um papel relevante da perturbação do eixo encéfalo-intestino.

Abstract: Long COVID is a condition that presents months or years after the acute phase of SARS-CoV-2 infection. One of the main symptoms reported by patients recovering from the acute phase of COVID-19 is related to cognitive function, such as difficulty concentrating and learning, and memory loss; this cognitive impairment is referred to as brain fog. Previous non-clinical studies have evaluated the effect of local exposure to the virus's Spike protein on the brain parenchyma, reinforcing the hypothesis that delayed glial cell reactivity is the main pathophysiological component responsible for cognitive impairment in Long COVID. Given the translational need to evaluate the effect of systemic exposure to Spike protein on the central nervous system (CNS), this study aims to investigate the hypotheses that disruption of the gut-brain axis by systemic exposure to this viral component contributes to neuroinflammation and late cognitive decline, which would be accompanied by increased permeability of the intestinal and blood-brain barriers (BBB), facilitating the translocation of enteric lipopolysaccharide into the systemic circulation and, subsequently, into the CNS, acting synergistically with Spike. Therefore, in this study, male and female C57BL/6 mice were divided into three experimental groups and systematically exposed to Spike protein in its active or denatured form (10 µg/100 µL; s.c.) or vehicle only (PBS, 100 µL; s.c.). From the 3rd and 30th days post-infusion (d.p.i.), the animals underwent behavioral tests representing the acute and late phases, respectively, with a 23-day interval between each phase. Tests performed included open field (OF), novel object recognition (NOR), Y-maze (YM), Morris water maze (MWM), olfactory discrimination (OD), elevated plus maze (EPM), and light/dark box (LDC). Intestinal barrier permeability was functionally assessed by fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation and by measuring serum LPS levels, while the blood-brain barrier (BBB) was evaluated by measuring Evans Blue dye extravasation into the brain. After euthanasia, hippocampal and ileal samples were collected for the measurement of inflammatory and oxidative parameters. Furthermore, a histopathological and morphometric analysis of the brain and enteric tissues was performed, as well as the determination of mucin levels in the ileum. The results revealed that systemic exposure to the Spike protein caused impairment of locomotor and exploratory activity in the acute CA test in females, which may indicate the supposed sickness behavior associated with a systemic infection during this period, and was not observed in the late phase. Similarly, females presented characteristics related to anxiety-like behavior in the acute phase of the CCE test, a result that was maintained in the late phase and was also transmitted in the LCE. Regarding cognitive function, both males and females showed cognitive impairment, which was evidenced by the tests of RON and LAM. Both the anxiety-like behavior in females and the cognitive impairment observed in both sexes may be related to the probable neuroinflammatory and neuro-oxidative effect evidenced in the hippocampus of males and females in the late phase. Both males and females exhibited an inflammatory and oxidative profile in ileum samples, as well as morphometric alterations in the tissue histoarchitecture. Interestingly, only females showed increased intestinal permeability, which may explain the increased serum LPS levels, while males maintained the integrity of this physiological barrier. Similarly, increased BBB permeability was observed only in females. In conclusion, sexual dimorphism regarding systemic exposure to Spike on behavioral parameters is evident, as is the possible mechanism behind these findings and cognitive decline in both sexes. These alterations, along with the inflammatory and oxidative effects in females, were accompanied by impairment of the intestinal and blood-brain barriers, possibly indicating a significant role for disruption of the brain-gut axis.