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Abstract:
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O câncer de pulmão, especialmente o câncer de células não pequenas (NSCLC), é uma das neoplasias mais letais e de maior incidência global. Alterações nos genes NFE2L2 ou KEAP1 levam à superativação do fator de transcrição NRF2, que está associado a resistência à quimioterapia e pior prognóstico clínico. Nesse contexto, o CRISPR-Cas9 é uma ferramenta promissora para edição genética, sendo que as nanopartículas lipídicas (NPLs) se destacam como vetores eficazes, devido à sua biocompatibilidade e alta eficiência de encapsulamento. Durante o período de vigência da bolsa de Iniciação Científica, foram desenvolvidas atividades com o objetivo de estabelecer um protocolo para o knockout de NFE2L2 em células A549 usando CRISPR-Cas9, reconstituindo a função normal dessa via. A integridade e funcionalidade dos plasmídeos foram confirmadas por digestão em gel, purificação espectrofotométrica (NanoDrop), transformação bacteriana e PCR de colônia para verificação do gRNA. Paralelamente, buscou-se desenvolver um sistema nanocarreador composto por NPLs acopladas a anticorpos para entrega tecido-específica de ácidos nucleicos. A conjugação do anticorpo ocorreu por meio de reação química, usando EDC e sulfo-NHS. A purificação das NPLs se deu através de ultracentrifugação ou duas diálises sequenciais. Já a internalização celular das NPLs foi analisada por microscopia de fluorescência, e o impacto na viabilidade celular foi avaliado pelo método do MTT. Os resultados demonstram a validação dos plasmídeos quanto à digestão, purificação e funcionalidade em Escherichia coli. A presença do gRNA reverse foi confirmada por PCR de colônia, com controles negativos evidenciando a especificidade do ensaio. Já em relação ao sistema nanocarreador, as NPLs de núcleo eletrodenso apresentaram tamanho, índice de polidispersão (PdI) e potencial zeta compatíveis com aplicações biológicas e alta eficiência de encapsulação do material genético. A internalização das NPLs foi eficaz nas linhagens A549 e H460, sendo observada a partir de meia hora após o tratamento com as NPLs. Além disso, as NPLs não conjugadas apresentaram citotoxicidade variável, sendo maior nas linhagens H460 e L929 e menor em A549 e MDA-MB-231. Após a conjugação e posterior purificação, houve melhora expressiva no perfil de toxicidade das NPLs, mantendo parâmetros físico-químicos adequados e indicando estabilidade das mesmas. Portanto, o plasmídeo para edição do gene NFE2L2 via CRISPR/Cas9 foi desenvolvido e validado quanto à sua integridade e funcionalidade Ademais, o sistema nanocarreador apresenta parâmetros físico-químicos adequados, promovendo internalização eficaz nas linhagens A549 e H460, com baixa citotoxicidade após purificação. |
