Avaliação de Bacillus para controle de Stromatinia cepivora e Setophoma terrestris e promoção de crescimento de alho cultivado sob condições controlada

Abstract

A cultura do alho (Allium sativum L.) tem grande importância econômica no Brasil e é fonte de emprego e geração de renda na região do planalto catarinense, principalmente por pequenos e médios produtores. Essa cultura sofre com diversos patógenos causadores de prejuízos. Dentre as suas principais doenças, a podridão branca causada por Stromatinia cepivora e podridão rosada (Setophoma terrestris) causam danos severos, podendo chegar a 100% de prejuízo. O controle químico é pouco eficiente para esses fitopatógenos e o controle biológico pode ser uma alternativa para o seu controle. Estudos evidenciam Bacillus spp. como agentes de biocontrole por apresentar mecanismos de inibição aos patógenos, além de apresentarem potencial de promover o crescimento de plantas por diferentes ações. Assim, objetivou-se avaliar isolados do gênero Bacillus no controle dos fungos fitopatogênicos S. cepivora e S. terrestris, além do seu potencial em estimular o crescimento de alho, gerando assim prática de manejo sustentáveis e a para otimização da cultura. No primeiro momento, utilizou-se 27 isolados de Bacillus spp. para testar o potencial em solubilizar fosfato de ferro e alumínio in vitro, adicionando-se cada isolado em pontos equidistantes da placa com meio específico. O mesmo procedimento foi realizado para o teste de produção de quitinase e celulase em que, a única fonte de carbono foi a quitina e o CMC (carboximetilcelulose), respectivamente. Após os testes, foram selecionados dois isolados (EB13 e EB18) para proceder às demais análises, referente a produção de antibióticos, especialmente do grupo das fenazinas, por meio de extrato celular e análise na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Em seguida foram realizados testes de antibiose com S. cepivora e S. terrestris. Analisou-se a dinâmica de crescimento dos isolados selecionados, crescidos em meio LB (Luria Bertani) por 48h a 27 ºC, em que se determinou o número de unidades formadoras de colônias (UFC) em diferentes intervalos de tempo. Para os experimentos de micropropagação, foram utilizadas como explantes, as gemas apicais dos bulbilhos de alho cv Chonan, que foram mantidas em 10 mL de meio líquido MS (Murashige & Skoog), sobre ponte de papel filtro. As culturas fúngicas foram mantidas em incubadora BOD com fotoperíodo de 12 horas a 19 ºC (para S. cepivora) e 25 °C (para S. terrestris) e as bacterianas a 27 °C, sem fotoperíodo. Após 15 dias, efetuouse a inoculação dos isolados bacterianos diluídos a 101 UFC. mL-1 . Após 15 dias da inoculação bacteriana foi adicionado um microescleródio de cada fungo patogênico separadamente. As avaliações foram realizadas aos 45 dias para os testes com S. cepivora e 42 dias para S. terrestris. Para o experimento em casa de vegetação, utilizou-se também a cv. Chonan e testouse, apenas S. cepivora. O alho foi cultivado em vasos de 5 L, contendo solo da região de Curitibanos/SC. As culturas fúngicas e bacterianas foram mantidas nas condições já descritas. O delineamento inteiramente casualizado continha seis tratamentos, sendo esses: testemunha, inoculação de EB13, inoculação de EB18, Inoculação somente do patógeno, EB13 + patógeno e EB18 + patógeno. Os vasos inoculados com S. cepivora, receberam 2044 microescleródios. Os bulbilhos de alho foram previamente vernalizados por 30 dias a 4 °C. Foram desinfestados e inoculados com os isolados bacterianos, de acordo com o tratamento. Aos 30, 60 e 90 DAS, avaliou-se as alturas das plantas. Aos 90 DAS, o número de folhas, o diâmetro da haste, as massas úmida e seca da parte aérea, de raiz e de bulbo. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e quando significativo, realizou o teste de média Scott-Knott a 5% de significância em todos os experimentos. Dos 27 isolados testados, apenas EB13 demonstrou capacidade de solubilizar fosfatos de ferro. Dezessete isolados (63%) solubilizaram fosfato de alumínio. Todos os isolados apresentaram capacidade de produzir quitinase. Para a produção de celulase, apenas no isolado EB14 não foi detectado. As curvas de crescimento dos isolados mostraram que EB13 atinge o ápice da fase exponencial 24h após a inoculação (108 UFC. mL1 ) e EB18, 12h (107 UFC. mL-1 ). Os isolados EB13 e EB18 produziram compostos antimicrobianos. O extrato celular de EB13 controlou o 16,70% do crescimento de S. terrestris in vitro. Nos testes com alho micropropagado com S. cepivora, as inoculações com os isolados não apresentaram diferença em relação à testemunha. Nos ensaios com S. terrestris, a testemunha sobressaiu aos demais tratamentos. No experimento em casa-de-vegetação, não foi observado sintoma da podridão branca (S. cepivora). Entretanto, a inoculação com o isolado EB18 na presença do S. cepivora estimulou significativamente os parâmetros avaliados, com exceção da massas fresca e seca da raiz e do bulbo. Com base nosresultados obtidos, observouse que dentre os mecanismos de crescimento testados in vitro, alguns isolados de Bacillus spp. testados apresentaram capacidade de solubilizar AlPO4 e de produzir enzimas hidrolíticas. Os isolados selecionados, EB13 e EB18, produziram o antibiótico fenazina, e o extrato celular de EB13 inibiu crescimento do S. terrestris. Esses resultados indicaram potencial de promoção/proteção ao crescimento de alho. Os experimentos de micropropagação indicaram que os isolados apresentaram comportamento neutro no experimento, sendo necessário ajustes na metodologia. Em casa de vegetação, o isolado EB18 apresentou efeito no estímulo ao crescimento do alho.

Abstract: Garlic (Allium sativum L.) is a major economic crop in Brazil and a source of employment and income generation in the Santa Catarina plateau region, primarily for small and mediumsized producers. This crop is affected by several pathogens that cause damage. Among its main diseases, white rot caused by Stromatinia cepivora and pink rot (Setophoma terrestris) cause severe damage, potentially reaching 100%. Chemical control is ineffective against these phytopathogens, and biological control may be an alternative. Studies highlight Bacillus spp. as biocontrol agents due to their pathogen-inhibiting mechanisms and potential to promote plant growth through various actions. Therefore, this study aimed to evaluate isolates of the genus Bacillus for controlling the phytopathogenic fungi S. cepivora and S. terrestris, as well as their potential to stimulate garlic growth, thus generating sustainable management practices and optimizing the crop. Initially, 27 Bacillus spp. isolates were used to test their potential to solubilize iron and aluminum phosphate in vitro, adding each isolate to equidistant points on the plate with specific medium. The same procedure was performed for the chitinase and cellulase production test, in which the sole carbon sources were chitin and CMC (carboxymethyl cellulose), respectively. After the tests, two isolates (EB13 and EB18) were selected for further analyses, regarding antibiotic production, especially from the phenazine group, through cell extract and high-performance liquid chromatography (HPLC) analysis. Antibiosis tests were then performed with S. cepivora and S. terrestris. The growth dynamics of the selected isolates were analyzed, grown in LB (Luria Bertani) medium for 48 h at 27 °C, and the number of colony-forming units (CFU) was determined at different time intervals. For the micropropagation experiments, the apical buds of garlic cv. Chonan bulbs were used as explants, maintained in 10 mL of MS liquid medium (Murashige & Skoog) on a filter paper bridge. Fungal cultures were maintained in a BOD incubator with a 12-h photoperiod at 19 °C (for S. cepivora) and 25 °C (for S. terrestris), and bacterial cultures were maintained at 27 °C, without photoperiod. After 15 days, bacterial isolates diluted to 101 CFU mL-1 were inoculated. Fifteen days after bacterial inoculation, a microsclerotia of each pathogenic fungus was added separately. Evaluations were performed at 45 days for tests with S. cepivora and 42 days for S. terrestris. For the greenhouse experiment, cv. Chonan and only S. cepivora was tested. Garlic was grown in 5-L pots containing soil from the Curitibanos, Santa Catarina, region. Fungal and bacterial cultures were maintained under the conditions previously described. The completely randomized design contained six treatments: control, EB13 inoculation, EB18 inoculation, pathogen-only inoculation, EB13 + pathogen, and EB18 + pathogen. Pots inoculated with S. cepivora received 2,044 microsclerotia. Garlic bulblets were previously vernalized for 30 days at 4 °C. They were disinfested and inoculated with bacterial isolates, according to the treatment. At 30, 60, and 90 DAS, plant heights were evaluated. At 90 DAS, leaf number, stem diameter, and shoot, root, and bulb wet and dry weights were measured. The data were subjected to analysis of variance (ANOVA) and, when significant, the Scott-Knott mean test was performed at 5% significance level in all experiments. Of the 27 isolates tested, only EB13 demonstrated the ability to solubilize iron phosphates. Seventeen isolates (63%) solubilized aluminum phosphate. All isolates showed the ability to produce chitinase. Cellulase production was not detected only in isolate EB14. The growth curves of the isolates showed that EB13 reached the peak of the exponential phase 24 h after inoculation (108 CFU mL-1 ) and EB18, 12 h (107 CFU mL-1 ). Isolates EB13 and EB18 produced antimicrobial compounds. The EB13 cell extract controlled 16.70% of S. terrestris growth in vitro. In tests with garlic micropropagated with S. cepivora, inoculations with the isolates showed no difference in relation to the control. In the tests with S. terrestris, the control stood out from the other treatments. In the greenhouse experiment, no symptoms of white rot (S. cepivora) were observed. However, inoculation with the EB18 isolate in the presence of S. cepivora significantly stimulated the evaluated parameters, with the exception of fresh and dry weight of the root and bulb. Based on the results obtained, it was observed that among the growth mechanisms tested in vitro, some Bacillus spp. isolates tested presented demonstrated the ability to solubilize AlPO4 and produce hydrolytic enzymes. The selected isolates, EB13 and EB18, produced the antibiotic phenazine, and the EB13 cell extract inhibited the growth of S. terrestris. These results indicated potential for promoting/protecting garlic growth. Micropropagation experiments indicated that the isolates displayed neutral behavior in the experiment, requiring adjustments to the methodology. In a greenhouse, isolate EB18 demonstrated an effect on stimulating garlic growth.